④ 移動相の調製
1. 有機溶媒と水混合の移動相
(例)メタノール / 水 = 70 / 30 1 L
特別に表記がない場合には、体積比(V/V)で移動相を調製します。
① メタノール 700 mL をメスシリンダーに量りとる。
② 蒸留水 300 mL を別のメスシリンダーに量りとる。
③ ①②を十分に混合した後、脱気を行う。
※溶媒の体積は温度によって変化するため、精密性・再現性をよく量るためには、容量を比重換算した重量で計量し調製します。下表にその調製例を示します。
メタノール:水 移動相 1 L の組成表
メタノール / 水 | メタノール(g) | 蒸留水(g) |
---|---|---|
90/10(v/v) | 711.9 | 99.8 |
80/20(v/v) | 632.8 | 199.6 |
70/30(v/v) | 553.7 | 299.5 |
60/40(v/v) | 474.6 | 399.3 |
50/50(v/v) | 395.5 | 499.1 |
40/60(v/v) | 316.4 | 598.9 |
30/70(v/v) | 237.3 | 698.7 |
20/80(v/v) | 158.2 | 798.6 |
10/90(v/v) | 79.1 | 898.4 |
アセトニトリル:水 移動相 1 L の組成表
アセトニトリル / 水 | アセトニトリル(g) | 蒸留水(g) |
---|---|---|
90/10(v/v) | 707.4 | 99.8 |
80/20(v/v) | 628.8 | 199.6 |
70/30(v/v) | 550.2 | 299.5 |
60/40(v/v) | 471.6 | 399.3 |
50/50(v/v) | 393.0 | 499.1 |
40/60(v/v) | 314.4 | 598.9 |
30/70(v/v) | 235.8 | 698.7 |
20/80(v/v) | 157.2 | 798.6 |
10/90(v/v) | 78.6 | 898.4 |
※メタノール、アセトニトリルは医薬用外劇物です。取り扱いは手袋・保護メガネ・マスクを着用し、ドラフト内で行ってください。
【参考】移動相の有機溶媒濃度の違いに対する保持時間の変化
メタノール濃度が 1% 違うだけで保持時間は大きく変わります。移動相は正確に調製してください。
Conditions | |||
---|---|---|---|
Column | 5C18-MS-II 4.6 mm I.D. × 150 mm | Detection | UV 254 nm 0.16 AUFS |
Flow rate | 1.0 mL/min | Sample |
|
Temperature | 30℃ |
2. 緩衝液の調製
(例 1)20 mmol/L りん酸緩衝液(pH 2.5)の調製
-
① 20 mmol/L りん酸二水素ナトリウム水溶液を調製する。(1 L のメスフラスコにりん酸二水素ナトリウム(無水)(#31720-65)2.40 g を量りとり、蒸留水で 1 L にメスアップする)
② 20 mmol/L りん酸水溶液を調製する。(1 L のメスフラスコにりん酸(純度 85%)(#08964-92)2.31 g を量りとり、蒸留水で 1 L にメスアップする)
③ pH メーターで測定しながら、pH 2.5 になるように①と②を混合する。
④ ミリカップ-HV(0.45 µm)(#44054-89)を用いて減圧ろ過する。
※塩類は不溶性固体を含有している場合があり、ポンプのシールの劣化や、カラムの詰まりの原因になるので、必ずろ過してください。
⑤有機溶媒と混合する場合には「1. 有機溶媒と水混合の移動相」の例と同様に体積比で混合してください。
※混合時に塩が析出していないか確認してください。時間経過後、析出する場合もあります。
調製済みの緩衝液〔りん酸緩衝液(pH2.5)(5倍濃縮)(#08969-71)〕を販売していますのでご利用ください。
(例 2)20 mmol/L りん酸緩衝液(pH 7.0)の調製
① 20 mmol/L りん酸二水素ナトリウム水溶液を調製する。(1 L のメスフラスコにりん酸二水素ナトリウム(無水)(#31720-65)2.40 g を量りとり、蒸留水で 1 L にメスアップする)
② 20 mmol/L りん酸水素二ナトリウム水溶液を調製する。(1 Lのメスフラスコにりん酸水素二ナトリウム(無水)(#31801-05)2.84 g を量りとり、蒸留水で1L にメスアップする)
③ pH メーターで測定しながら、pH 7.0 になるように①と②を混合する。
④ ミリカップーHV(0.45 µm)(#44054-89)を用いて減圧ろ過する。
※塩類は不溶性固体を含有している場合があり、ポンプのシールの劣化や、力ラムの詰まりの原因になるので、必ずろ過してください。
⑤ 有機溶媒と混合する場合には「1. 有機溶媒と水混合の移動相」の例と同様に体積比で混合してください。
※混合時に塩が析出していないか確認してください。時間経過後、析出する場合もあります。
調製済みの緩衝液〔りん酸緩衝液(pH7.0)(5倍濃縮)(#08968-81)〕を販売していますのでご利用ください。
(例 3)5 mmol/L 1-へキサンスルホン酸ナトリウム,20 mmol/L りん酸緩衝液(pH 2.5)の調製
① 5 mmol/L 1-へキサンスルホン酸ナトリウム、20 mmol/Lりん酸二水素ナトリウム水溶液を調製する。(1Lのメスフラスコに、 1-へキサンスルホン酸ナトリウム(#31529-24) 0.94 g と、りん酸二水素ナトリウム(無水)(#31720-65)2.40 g を量りとり、蒸留水で 1 L にメスアップする)
② 5 mmol/L 1-へキサンスルホン酸ナトリウム、20 mmol/L りん酸水溶液を調製する。(1 L のメスフラスコに、1-へキサンスルホン酸ナトリウム(#31529-24) 0.94 g と、りん酸(純度 85%)(#08964-92)2.31 g を量りとり、蒸留水で 1 L にメスアップする)
③ pH メーターで測定しながら、pH 2.5 になるように①と②を混合する。
④ ミリカップーHV(0.45 µm)(#44054-89)を用いて減圧ろ過する。
※塩類は不溶性固体を含有している場合があり、ポンプのシールの劣化や、力ラムの詰まりの原因になるので、必ずろ過してください。
⑤ 有機溶媒と混合する場合には「1. 有機溶媒と水混合の移動相」の例と同様に体積比で混合してください。
※混合時に塩が析出していないか確認してください。時間経過後、析出する場合もあります。