ウェスタンブロッティング β-Actin の検出

① Chemi-Lumi One Markers
② HeLa 細胞タンパク質抽出液から β-Actin の検出

電気泳動	SDS-PAGE（4 ～ 20％ グラジェントゲル） Chemi-Lumi One Markers（5 μL）
転写	PVDF メンブレン	10 V、30 分
ブロッキング	Blocking One（#03953）	60 分
一次抗体	抗 β-アクチンモノクローナル抗体（マウス）200 倍希釈	60 分
二次抗体	抗マウス IgG〔H+L〕（ヤギ），HRP 標識（5,000 倍希釈） ＋ Streptavidin（HRP Conjugate）（10,000 倍希釈）	60 分
検出	Chemi-Lumi One Super（#02230） Chemi-Lumi One L（#07880）

本製品は精製水と試料緩衝液を用いて、Chemi-Lumi One Markers を 10 倍に希釈して使用します。ミニゲルの場合、1 ウェルに 2 ～ 10 μL 使用しますので、50 ～ 250 ウェル分使用可能です。

Chemi-Lumi One Markers

容量：50 μL
8 種類ビオチン標識タンパク質溶液

Protein	M.W.（kDa）
Myosin	210
β-Galactosidase	120
Bovine Serum Albumin	66
Ovalbumin	45
Carbonic Anhydrase	31
Trypsin Inhibitor	22
Lysozyme	14
Aprotinin	6.5

（注）タンパク質へのビオチン結合量はコントロールすることができないため、ロットにより分子量が若干異なることがあります。

Streptavidin（HRP Conjugate）

容量：250 μL
西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン溶液

1. Chemi-Lumi One Markers の調製

1. Chemi-Lumi One Markers を使用前に、十分混合します。
2. 蓋付きプラスチック容器（容量 0.5 ～ 1.5 mL）に精製水 4 μL、試料緩衝液(SDS-PAGE 用, 2 倍濃縮, 2-ME 含有)（#30566-22）5 μL と Chemi-Lumi One Markers 1 μL を分注し、混合します。
   他の容量で調製する場合、精製水、試料緩衝液(SDS-PAGE 用, 2 倍濃縮, 2-ME 含有)、Chemi-Lumi One Markers を容量比 4:5:1 で混合してください。
3. プラスチック容器の蓋をして、90℃ 程度の水浴中で 4 分、加熱処理します。
4. 水浴から取り出して、約 10 分冷やします。 
5. マイクロピペットを用いて上記調製した溶液 2 ～ 10 μL を分取し、電気泳動ゲルに添加してください。
6. 電気泳動、メンブレンへの転写、ブロッキング、一次抗体（必要に応じて）の反応を行ってください。

2. Streptavidin（HRP Conjugate）の反応

1. Streptavidin（HRP Conjugate）を解凍し、穏やかに混合してください。
2. メンブレンサイズが 10 cm × 10 cm をご使用の場合は、50 mL の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体希釈液に 5 μL の Streptavidin（HRP Conjugate）を添加し、穏やかに混和してください。他の容量で調製する場合は、二次抗体の希釈液と Streptavidin（HRPConjugate）を容量比 10,000:1 になるように調製してください。
3. 上記の通り調製した溶液[二次抗体と Streptavidin（HRP Conjugate）の混合液]を、メンブレン上のタンパク質に 1 時間反応させてください。
4. 上記メンブレンを 100 mL の tPBS（0.05% Tween20 を含む PBS）で 3 分洗浄後、tPBS を除去します。この洗浄をさらに 3 回繰り返してください。
5. 以下の試薬で検出してください。
   ・Chemi-Lumi One L（#07880）
   ・Chemi-Lumi One Super（#02230）
   ・Chemi-Lumi One Ultra（#11644）
   ・Peroxidase Stain Kit （#26652-70）

Tween はクローダ インターナショナル ピーエルシーの登録商標です。