図1.脳のホールマウントの顔部分と頭がい部分を神経トレーシングした共焦点映像

E12.5 マウス胚の脳ホールマウント（上図）およびその中心射影（下図AおよびB）。迷走神経、三叉神経、顔部/VIII/舌咽神経をそれぞれ、NeuroVue^® Jade、Red、Maroonを用いてラベル化した。

蛍光イメージ：緑色：迷走神経、赤色：三叉神経、紺色：顔部/VIII/舌咽神経

グリセロール中の脳のホールマウント。下図の共焦点映像AおよびBは、上図の四角で囲まれたAおよびB部分の共焦点映像を撮影したもの。

映像は、BioRad社Radiance 2000 confocal system、励起波長488nm、568nm、637nmを用いて映像化した。NeuroVue^® Jade、Red、Maroonは、それぞれ500nm、650nmの2色性ミラーと515/40nm BP、 600/40nm BP、660nm LPを用いて検出した。

図2.Murine内耳蝸牛の表面サンプルの神経分布の共焦点映像

通常観測することが困難とされる、非常に薄いType II inner hair cell（IHC）も単一の神経線維レベルで可視化できる。

Murineの内耳をNeuroVue^® Red（red pseudocolor）、NeuroVue^® Maroon（green pseudocolor）により2重ラベルした後、outer hair cell（OHC）およびinner hair cell（IHC）の求心性神経および遠心性神経線維を低、中、高解像度で映像化した。例1（上図；Scale bar=2mm）は、蝸牛軸にNeuroVue^® Redを用いてラベル化されており（図3参照）、全ての蝸牛の神経線維が強力にラベル化されている。例2（図中央および下図）は、蝸牛軸はラベル化されていないが、上図の図式化（図中の赤色および緑色の長方形）部位の尖端にNeuroVue^® Red、NeuroVue^® Maroonのマイクロストリップが挿入されている。このように尖端に挿入することで、わずかな神経線維のラベル化を可能とし、中解像度（図中央；Scale bar=100μm）および高解像度（下図；Scale bar=10μm）で、OHCおよびIHCそれぞれのタイプII求心性神経（赤色）および遠心性神経線維の分岐（緑色）を鮮明に可視化することが可能である。生後1週間（P7）のmurine蝸牛表層は以下の操作でラベル化された。色素は、4%ホルムアルデヒド（in PBS）、37℃、48時間の条件でインキューベーションした。

図3.蝸牛の断面のイメージングにおける、murine内耳細胞の放射状の神経線維とコルチ器官の支持細胞との相互作用を観測した共焦点映像

eGFP（green pseudocolor）とNeuroVue^® Red（red pseudocolor）により2重ラベル化することで、内耳の神経線維およびトランス遺伝子によりラベル化された細胞を高解像度で映像化することが可能である。
（Morris et al., Brain Res 1091：186-199 2006）

Low power（scale bar=100μm）

蛍光イメージ　赤色：神経線維、緑色：PLP-eGFP遺伝子が発現した細胞

NeuroVue^® Redでラベル化した神経線維の共焦点映像（red pseudocolor）とPLP-eGFP（green pseudocolor）でラベル化された細胞（green pseudocolor）の単一光映像を重ね合わせた映像。この映像より、PLP-eGFPを発現しているのは、らせん状のガングリオン細胞を囲むSchwann細胞およびコルチ器官の支持細胞である。これらの細胞は、黄色の細切れのようにイメージングされる。

High power（scale bar=10μm）

NeuroVue^® Redで赤色にラベル化された神経線維がeGFPラベル化された支持細胞を通って伸張していくのがわかる。

図4.2色の神経トレーシング色素を用いて、別々に撮った組織イメージを解剖学的に重ね合わせた図

卵形嚢にNeuroVue^® Maroon（図A：green pseudocolor）、蝸牛にNeuroVue^® Red（図B：red pseudocolor）を用い2重ラベルすることで、E18.5マウス後脳の脳幹において、重複している細胞や神経線維の分布を可視化することが可能である。37℃、96時間の条件で、NeuroVue^®とインキューベーションした後、15%ゼラチン上で、vibratomeを用いて 100μmの切片を作製した。作製された切片はグリセロールでマウントし、NeuroVue^® Redに関しては励起波長：543nm、検出波長：565-615nmの条件で、NeuroVue^® Maroonに関しては励起波長：633nm、検出波長：650-710nmの条件で、Zeiss LSM 510 Meta confocal systemを用いて映像化した。映像Aと映像Bを重ね合わせていない映像では、各々の色素により、単一の細胞および線維レベルを映像化することが可能である。映像Aと映像Bを重ね合わせた映像（図C）では、前庭神経核求心性線維は、NeuroVue^® Maroonのみにラベル化され、蝸牛神経核求心性線維は、NeuroVue^® Redのみにラベル化されている。その一方で、双方の神経線維が重複している部分（yellow pseudocolor）は、前庭蝸牛遠心性束で確認される。Scale bar=100μm

色素拡散速度例

色素が拡散する速さは、i）目的とする部位までの距離、ii）NeuroVue^®色素の濃度、iii）インキュベーション温度、iv）組織の固定度合（固定化剤の濃度、固定化時間）などのパラメーターによって変ります。

マウス（耳～脳）組織を用いたときの拡散時間

発達段階	時間(37℃)
Embryonic day 11.5 (E11.5)	24 – 36時間
Embryonic day 13.5 (E13.5)	48 – 60時間
Embryonic day 16.5 (E16.5)	72 – 80時間
Newborn (P0)	80 – 96時間

各NeuroVue^®の蛍光特性

製品名	メーカー 製品番号	励起波長 （Max）	蛍光波長 （Ｍａx）	分子吸光係数 （M-1cm-1）
NeuroVue® Maroon	FS-1001	647nm	667nm	222,368
NeuroVue® Red	FS-1002	567nm	588nm	135,000
NeuroVue® Orange	FS-1003	550nm	570nm	139,800
NeuroVue® Burgundy	FS-1005	683nm	707nm	192,832
NeuroVue® Jade	FS-1006	478nm	508nm	87,850
NeuroVue® Red Plus*	FS-1007	567nm	588nm	135,000

*NeuroVue^® Red Plus（FS-1007）はNeuroVue^® Red（FS-1002）の1.5倍量の蛍光色素を含みます。

マルチカラー解析時のNeuroVue^®の選択例

励起・検出装置に適したNeuroVue^®を選択してください

マルチカラー	NeuroVue®の 組み合わせ	装置
3カラー解析 （≦5日）	NeuroVue® Jade NeuroVue® Red NeuroVue® Maroon	標準的な落射蛍光顕微鏡 共焦点システム （励起：488、568、633/647nm）
	NeuroVue® Jade NeuroVue® Orange NeuroVue® Maroon	標準的な落射蛍光顕微鏡 共焦点システム （励起：488、543、633/647nm）
4カラー解析 （3-4週間）*	NeuroVue® Orange NeuroVue® Red NeuroVue® Maroon NeuroVue® Burgundy	スペクトル検出可能なシステム （Spectral Unmixing機能必須： Orange/RedとMaroon/Burgundy の重複しているスペクトル特性を正確に分離できる装置）
5カラー解析 （≦5日）	NeuroVue® Jade NeuroVue® Orange NeuroVue® Red NeuroVue® Maroon NeuroVue® Burgundy
*Reference：Compatible with green fluorescent genetic markers such as eGFP or photoactivated X-Gal reaction product BCI [Matei, Brain Res Bull 70:33-43, 2006]

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