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TUBE (Tandem Ubiquitin Binding Entity)


TUBEはポリユビキチンへ高い親和性で結合する人工タンパク質で、培養細胞や生体組織のユビキチン化タンパク質を精製する、または検出するのに最適です。本製品はスペインの研究機関CIC bioGUNEで開発され*1、LifeSensors社がライセンスを受けて生産しています。


*1: Hjerpe, R. et al. Efficient protection and isolation of ubiquitylated proteins using tandem ubiquitin-binding entities. EMBO Rep. 10(11),1250-1258 (2009).

特長

  • ユビキチンに対する特異性と親和性が抗体よりも高い
  • 困難だった内在性の微量なポリユビキチン化タンパク質のプルダウンが可能
  • 細胞溶解時のプロテアソームや脱ユビキチン化酵素による消化を防止

原理図

原理

TUBE（4つ連なった黒い欠円）はユビキチン（U）へ結合して、脱ユビキチン化酵素（DUB）による脱ユビキチン化やプロテアソームによる分解を防ぎます。
TUBEにTag/Conjugate（GST、His6、Biotin、Agarose）が融合/連結しており、例えば左図のようにGSTが融合しているGST-TUBEsであればグルタチオン-レジンを使用してGSTプルダウンをすることができます。

ラインアップ

ラインアップ
*2:使用方法を限定するものではありません
UBA:Ubiquitin Binding Associated domain

プロトコール

■ GST-TUBEまたはHis6-TUBEを用いた精製

  1. 細胞溶解液（例えばRIPAバッファー）を4℃に冷やす
  2. 500µlの細胞溶解液へTUBEを終濃度100-200µg/ml（1.8-3µM）になるように加える
  3. 洗浄した細胞（1.5x106 cell）へ500µlの細胞溶解液を加える
  4. 細胞と細胞溶解液を1.5mlチューブへ回収する
  5. 氷上で15分インキュベーション
  6. 4℃、10分、～14,000gで遠心分離
  7. 上清を回収する
  8. グルタチオン-レジンまたは金属イオンアフィニティークロマトグラフィー担体を用いて精製する

■ Agarose-TUBEを用いた精製

  1. 細胞溶解液（例えばRIPAバッファー）を4℃に冷やす
  2. 洗浄した細胞（1.5x106 cell）へ500µlの細胞溶解液を加える
  3. 細胞と細胞溶解液を1.5mlチューブへ回収する
  4. 4℃、10分、～14,000gで遠心分離
  5. Agarose-TUBEを細胞溶解液へ加える
  6. 4℃、4時間インキュベーション
  7. 4℃、5分、～1,000gで遠心分離
  8. 上清を除き、Agarose-TUBEをTBS-Tで洗浄する
  9. 0.2M グリシン-塩酸バッファー, pH2.5 で4℃、1時間以上 インキュベーション
  10. 5分、13,000gで遠心分離
  11. 上清を回収する

性能評価

■ TUBE1,2、UBAとポリユビキチンとの親和性の比較

性能評価

Ubiquilin1由来またはヒトHR23A由来のUBA、TUBEと293細胞溶解液を用いてプルダウンをし、ウェスタンブロッティング（ポリユビキチン抗体）によりポリユビキチン化タンパク質を検出しました。その結果、TUBEのポリユビキチンに対する親和性がUBAの1000倍以上でした。
■ Biotin-TUBE1を用いたFar-ウェスタンブロッティング

性能評価

Neuro2A細胞由来のタンパク質約40µgを用いてウェスタンブロッティングおよびfar-ウェスタンブロッティングを行いました。TUBE（Biotin-TUBE1）を用いると抗体よりも高感度にユビキチン化タンパク質が検出されました。
  • Strip1：抗ユビキチン抗体により検出
  • Strip2：メンブレンを熱処理してから抗ユビキチン抗体により検出
  • Strip3：TUBE （0.2µg/ml）により検出
  • Strip4：TUBE （1µg/ml）により検出
■ プルダウンにより回収される量比較

性能評価

HEK293T細胞の溶解液（総タンパク質量～4mg）からAgarose-TUBEまたは他社相当品10µlを用いプルダウンによりユビキチン化タンパク質を回収し、非結合画分と溶出液をウェスタンブロッティング（抗ユビキチン抗体）による検出を行いました。
Agarose-TUBEはA社品やB社品よりもユビキチン化タンパク質を多く回収できていることがわかります。
  • U：非結合の画分
  • E：溶出液

実施例

■ Agarose-TUBE1によるユビキチン化タンパク質の検出

実施例

HEK293T細胞の溶解液（総タンパク質量約5mg）からAgarose-TUBE1 10µlを用いプルダウン後、ウェスタンブロッティング（抗ユビキチン抗体）による検出を行いました。
Agarose-TUBE1によりユビキチン化タンパク質が回収できていることがわかります。
  • Input：細胞溶解液
  • FT：フロースルー
  • Elution：TUBE溶出液

価格表

Tag/Conjugate 製品名 貯法 メーカー
製品番号		 容量 価格
GST GST-TUBE1 -80℃ UM101 200 µg (5 mg/ml) 54,000
GST-TUBE2 -80℃ UM102 200 µg (5 mg/ml) 54,000
His6 His6-TUBE1 -80℃ UM201 200 µg (5 mg/ml) 54,000
His6-TUBE2 -80℃ UM202 200 µg (5 mg/ml) 54,000
His6-TUBE3 -80℃ UM203 200 µg (5 mg/ml) 54,000
Biotin Biotin-TUBE1 -80℃ UM301 200 µg (5 mg/ml) 54,000
Biotin-TUBE2 -80℃ UM302 200 µg (5 mg/ml) 54,000
Agarose Agarose-TUBE1 -20℃ UM401 1 ml (50%スラリー) 78,000
Agarose-TUBE2 -20℃ UM402 1 ml (50%スラリー) 78,000

＊TUBEを商業利用される場合はお問い合わせください。

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