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BCIP-NBT溶液キット

本製品は、ブロッティングに最適な高感度のアルカリホスファターゼ染色キットで、目的のタンパク質を迅速・高感度に検出することができます。

 

特長

• ブロッティングに最適な、高感度のアルカリホスファターゼ染色キット
• 本製品の緩衝液は、アルカリホスファターゼ（ALP）の酵素反応促進剤含有で、従来法と同等の検出感度が約半分の反応時間で得ることが可能
• 染色に必要な試薬はすべて含まれており、簡単な調製ですぐに使用可能
• 発色剤にニトロブルーテトラゾリウム（NBT）を用いており、生成する色素が不溶となり、明瞭なスポットあるいはバンドとして検出
• 発色性基質であるブロモクロロインドリルりん酸（BCIP）と発色剤であるNBTの混合による沈殿や着色は無し

 

 

測定原理

本製品はアルカリホスファターゼの発色性基質であるBCIPが、反応により青色を呈します。また、その反応によりNBTが酸化されて紫色の不溶性沈殿となり、明瞭なスポットとして検出されます。

 

 

使用方法

ウェスタンブロッティングでの使用方法を示しました。

発色液の調製
緩衝液を十分に転倒混和し、清潔なメスシリンダーに緩衝液100容量と発色原液１容量の割合で混和します。

染色方法

1. プロッティングで膜上に固定した抗原にアルカリホスファターゼ標識抗体を反応させた後、界面活性剤（0.05% Tween20など）を含んだトリス緩衝生理食塩水（TBS）で十分に洗浄します。
2. 調製した発色液を清潔なプラスチック製トレイに入れ、洗浄した膜を浸して15分間以上室温で静置または振とうします。
3. 膜上に泳動像の適当な染色が得られたら、膜を発色液から取り出して流水で10分間以上洗浄して反応を停止させます。 

 

 

使用例

ドットブロッティング

本製品と従来法でアルカリホスファターゼを染色し、染色能を比較しました。 

操作条件

サンプル：Alkaline Phosphatase（ウシ小腸由来）
サンプル量：100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng
使用膜：PVDF膜（ニトロセルロース膜も使用可能です）

*従来法では酵素反応促進剤に塩化マグネシウムを使用しています。 

 

従来法と比較して

1. 緩衝液にアルカリホスファターゼの酵素反応促進剤を含んでいますので、従来法の検出感度が半分の反応時間で得られます。
2. 
   従来法と同じ反応時間の場合、高感度を示します。
3. バックグラウンドが低くなっています。 

 

ウェスタンブロッティング

ウェスタンブロッティングで膜上に固定した抗原に、アルカリホスファターゼ標識抗体を反応させた後、目的とするタンパク質を高感度に検出します。下記の実験では60ngのタンパク質が検出できました。

操作条件

サンプル：ヒト血清
サンプル量：①プレステインドマーカー　②5μg　③1.7μg　④0.55μg　⑤0.2μg　⑥60ng　⑦20ng
一次抗体：ヤギ抗ヒトIgG
二次抗体：ALP標識ウサギ抗ヤギIgG
電気泳動：12.5% SDS-PAGE（35mA、40分間）
使用膜：PVDF膜（ニトロセルロース膜も使用可能です）
発色時間：30分間 

 

 

比較データ

ドットブロット法による感度比較

条件
サンプル：Alkaline Phosphatase（ウシ小腸由来）
使用膜：PVDF膜
発色時間：15分間

①本製品（200ml分）　②
A社キット　③B社キット　④C社キット

今回の結果から、本製品が最も高感度であることが確認されました。さらにDNase、RNaseフリーですので、ハイブリダイゼーションにもご使用いただけます。

 

 

参考文献

1. Langer, P.R. & Ward, D.C. in Developmental Biology Using Purified Genes, ICN-UCLA Symposium on Molecular and Cellular Biology, ed.Brown, D.D.(Academic, New York) 23, 647-658 (1983).
2. Wilson, J.T., Wilson, L.B., deRiel, J.K., Villa-Komaroff, L., Efstratiadis, A., Forget, B.G. & Weissman, S.M., Nucleic Acids Res．5, 563-581 (1978).
3. Fukumaki, Y., Ghosh, P.K., Benz, E.J., Jr., Reddy, V.B., Lebowitz, P., Forget, B.G. &  Weissman, S.M., Cell 28, 585-593 (1982).
4. Hsu, S.M., Raine, L. & Fanger, H., J.Histochem.Cytochem．29, 577-580 (1981).
5. Karin, M., Andersen, R.D. & Herscheman, H.R., Eur.J.Biochem．118, 527-531 (1981).
6. Wigler, M., Sweet, R., Sim, G.K., Wold, B., Pellicer, A., Lacy, R., Maniatis, T., Silverstein, S. & Axel, R., Cell 16, 777-785 (1979).

 

 

使用上の注意

• 使用直前に発色液を調製し、調製後10分以内に発色反応を開始してください。調製後30分以上経過すると、良好な染色性能が得られない可能性があります。
• 発色液を入れるトレイは、プラスチック製を推奨します。ステンレス製トレイを用いた場合、トレイと発色液の接触面に色素が析出する場合があります。
• アルカリホスファターゼ標識抗体を反応させた後の膜洗浄に、りん酸緩衝生理食塩水を使用することは推奨できません。アルカリホスファターゼがりん酸と反応することにより、酵素活性を失う可能性があります。膜洗浄には、界面活性剤（0.05% Tween20など）を含んだトリス緩衝生理食塩水をご使用ください。
• 発色原液はジメチルスルホキシドを含有しています。万一、皮膚に付着した場合は、大量の水で洗い流してください。

 

 

キット内容

 

 

価格表

 

※記載の内容は、'02年8月現在の情報に基づいております。