ナカライテスク http://www.nacalai.co.jp/ ja Copyright 2010 Fri, 03 Sep 2010 15:04:36 +0900 http://www.sixapart.com/movabletype/ http://blogs.law.harvard.edu/tech/rss 超高速LC用カラムに2.5πNAP追加 コスモシール2.5πNAP はナフチルエチル基をシリカゲルに化学結合した逆相クロマトグラフィーカラムです。従来型のフェニルカラムよりも強いπ−π相互作用によってC18型カラムで分離できない化合物の分離に威力を発揮します。

分析例

 C18カラムで分離できない化合物や位置異性体などがコスモシール2.5πNAPにより分離が可能になります。また他社2μm充填剤カラムに対し、約1/2の圧力で使用することができます。詳細な情報はこちら

20100903-1.jpg

]]> http://www.nacalai.co.jp/cosmosil/news/lc25nap.html http://www.nacalai.co.jp/cosmosil/news/lc25nap.html Fri, 03 Sep 2010 15:04:36 +0900 超高速LC用カラムに2.5πNAP追加 コスモシール2.5πNAP はナフチルエチル基をシリカゲルに化学結合した逆相クロマトグラフィーカラムです。従来型のフェニルカラムよりも強いπ−π相互作用によってC18型カラムで分離できない化合物の分離に威力を発揮します。

分析例

 C18カラムで分離できない化合物や位置異性体などがコスモシール2.5πNAPにより分離が可能になります。また他社2μm充填剤カラムに対し、約1/2の圧力で使用することができます。詳細な情報はこちら

20100903-1.jpg

]]> http://www.nacalai.co.jp/update/lcni.html http://www.nacalai.co.jp/update/lcni.html Fri, 03 Sep 2010 14:28:47 +0900 蛍光退色防止剤入りMounting Medium EverBrite™ 蛍光退色防止剤入りMounting Medium   EverBrite™  biotiumlogo.gif

 

 

 

 

Biotium社のEverBrite™は、蛍光（可視光や近赤外を含む全て）退色を防止するmounting mediumです。主要な特長の一つとして、シアニン色素（Cy™2、Cy™5、Alexa Fluor®647、Dylight™649など）の蛍光の退色を防止します。本製品はお好みに合わせて水溶性と非水溶性（Hardset）をお選びいただけます。また、核の対比染色操作が不要なDAPI含有品もご用意しています。水溶性EverBrite™は、カバーグラスの端をマニキュアでシーリングした後すぐに観察することが可能です。非水溶性EverBrite™は乾燥させる必要はありますが、シール剤は不要です。封入後4℃で数週間から数ヶ月の保存が可能です。

 

特長

  • 広範囲の蛍光色素の退色を防止
  • 水溶性と非水溶性が選択可能核の対比染色用にDAPI含有製品もラインアップ
  • 核の対比染色用にDAPI含有製品もラインアップ
  • 封入後すぐに観察可能（水溶性）
  • 乾燥処理にシール剤不要（Hardset）
  • 封入後4℃で保存可能

 

biotium-Ever-FITC.png

 

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 A社製品使用によるCy™5の蛍光強度低下を表すために、データは補正されていません。

 

 

 

価格表

製品名

メーカー

製品番号

容量

価格

EverBrite™ Mounting Medium

 23001

10 ml

 22,000

EverBrite™ Mounting Medium with DAPI

 23002

10 ml

 24,500
EverBrite™ Hardset Mounting Medium 23003

10 ml

 近日発売
EverBrite™ Hardset Mounting Medium with DAPI 23004

10 ml

 近日発売

EverBrite™：Biotium社の商標です。

CyTM：GE Healthcare社の商標です。

Alexa Fluor®：Life Technologies社 の登録商標です。

Dylight™：Thermo Fisher Scientific社の商標です。

]]> http://www.nacalai.co.jp/products/new/mounting_medium_everbrite.html http://www.nacalai.co.jp/products/new/mounting_medium_everbrite.html 新製品情報 Fri, 27 Aug 2010 17:22:20 +0900 第39回フラーレン・ ナノチューブ 総合シンポジウム 付設展示会出展のご案内 http://www.nacalai.co.jp/information/society/1009_fns.html http://www.nacalai.co.jp/information/society/1009_fns.html Thu, 26 Aug 2010 15:19:17 +0900 Tocris社　新製品　7月追加分 Tocris社　新製品　7月追加分

 

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弊社取り扱いのTocris社の新製品7月追加分をまとめました。

 

下記表　製品名をクリックしていただくとTocris社Websiteに移動できます。製品詳細につきましてはTocris社Websiteをご覧ください。

 

価格表
製品名 説明 メーカー製品番号 容量 価格
AR-A 014418 GSK-3の選択的阻害剤。Sold with the permission of AstraZeneca UK Ltd. 3966 10 mg 47,500
50 mg 192,500
CD 3254 RXRαの強力で選択的なアゴニスト。 3302 10 mg 49,500
50 mg 219,500
ATC 0065 MCH1の強力で選択的なアンタゴニスト。 3359 10 mg 54,500
50 mg 244,500
SD 1008 JAK2/STAT3シグナル伝達経路の阻害剤。 3035 10 mg 42,500
50 mg 174,500
FFN511 VMAT2の蛍光基質。 3878 10 mg 57,500
50 mg 262,500
Neuropeptide Y (scrambled) Neuropeptide Yのコントロールペプチド。 3903 1 mg 49,500
SCH 221510 NOPの強力で選択的なアゴニスト。 3240 10 mg 49,500
50 mg 219,500
Zearalenone エストロジェン受容体のリガンド。マイコトキシン。 3975 10 mg 24,500
50 mg 104,500
UVI 3003 RXRのアンタゴニスト。 3303 10 mg 44,500
50 mg 192,500
GSK 789472 hydrochloride D3のアンタゴニスト。D2の部分的アゴニスト。 3940 10 mg 42,500
50 mg 174,500
LY 311727 分泌型ホスホリパーゼA2の選択的な阻害剤。 3627 10 mg 49,500
Eeyarestatin I ER結合性タンパク質の分解と輸送の強力な阻害剤。 3922 10 mg 57,500
Alexidine dihydrochloride PTPMT1の選択的な阻害剤。 3979 50 mg 22,500
TCS 1205 GABAA受容体のサブタイプ選択的なアゴニスト。 3941 10 mg 42,500
50 mg 174,500
GSK 3787 PPARδの強力で選択的なアンタゴニスト。 3961 10 mg 42,500
50 mg 174,500
PX 12 チオレドキシン-1の競合的阻害剤。 2954 10 mg 27,500
50 mg 121,000
HQL 79 ヒト造血性プロスタグランジンD合成酵素（H-PGDS）の阻害剤。 3530 10 mg 44,500
50 mg 192,500
AC 264613 PAR2受容体のアゴニスト。 3370 10 mg 44,500
50 mg 192,500
Deoxynivalenol マイコトキシン。タンパク質合成の強力な阻害剤。 3976 1 mg 22,500
SJN 2511 TGF-βRIの選択的阻害剤。 3742 10 mg 44,500
50 mg 192,500
Nalmefene d3 重水素化nalmefene。オピオイド受容体のアンタゴニスト。 3971 1 mg 79,500
SJ 172550 MDMX阻害剤。MDMX-p53相互作用を阻害。 3929 10 mg 44,500
50 mg 192,500
FR 180204 ERKの選択的阻害剤。 3706 10 mg 62,500
50 mg 272,500
NF 340 P2Y11の選択的なアンタゴニスト。 3830 10 mg 49,500
50 mg 219,500
Licarbazepine oxcarbazepineの活性代謝産物。 3865 10 mg 29,500
50 mg 119,500
FTI 277 FTI 276のプロドラッグフォーム。 2407 1 mg 32,500
FTI 276 ファルネシルトランスフェラーゼ（FTase）の阻害剤。抗腫瘍薬。 2406 1 mg 32,500
Rotigotine hydrochloride ドパミンD2およびD3のアゴニスト。 3896 10 mg 29,500
50 mg 127,500

なお、AR-A 014418（# 3966）につきましては、Tocris社はAstraZeneca社のライセンスを受けて発売しております。

]]> http://www.nacalai.co.jp/products/new/tocris7.html http://www.nacalai.co.jp/products/new/tocris7.html 新製品情報 Thu, 26 Aug 2010 10:30:11 +0900 日本生薬学会第57回年会 付設展示会出展のご案内 http://www.nacalai.co.jp/information/society/1009_shoyaku.html http://www.nacalai.co.jp/information/society/1009_shoyaku.html Wed, 25 Aug 2010 16:28:36 +0900 マイコプラズマ予防・除去キャンペーン マイコプラズマ関連製品を対象にキャンペーンをいたします。ぜひご活用ください。

 

期　　間：2010年8月23日(月)～9月24日(金)
内　　容：下記対象製品を希望納入価格の50%off

]]> http://www.nacalai.co.jp/products/campaign/post_2.html http://www.nacalai.co.jp/products/campaign/post_2.html キャンペーン情報 Sun, 22 Aug 2010 20:00:00 +0900 分析展2010/科学機器展2010出展のご案内 日時：2010年9月1日(水)～9月3日(金）10：00～17：00
会場：幕張メッセ国際展示場
弊社出展ブース：S-01(HALL5:mini/ソリューションコーナー)

 

busu.png

 

]]> http://www.nacalai.co.jp/update/20102010.html http://www.nacalai.co.jp/update/20102010.html Wed, 11 Aug 2010 09:50:02 +0900 リレーキャンペーン第6弾　日本語版カタログ2010発行記念 日本語版カタログ発行に合わせてInvivoGen社の主力商品である自然免疫関連商品を特別価格で提供します。是非、この機会をご活用ください。 

 

期間：2010年8月10日(火)～2010年9月24日(金)

内容：カタログ第4章掲載商品を25%offで提供

]]> http://www.nacalai.co.jp/products/campaign/invivogen62010.html http://www.nacalai.co.jp/products/campaign/invivogen62010.html キャンペーン情報 Mon, 09 Aug 2010 20:00:00 +0900 InvivoGen社 2010 カタログを発行しました。 https://www.nacalai.co.jp/ss/Contact/maker-catalog.cfm https://www.nacalai.co.jp/ss/Contact/maker-catalog.cfm Mon, 09 Aug 2010 11:02:16 +0900 IBA社 MATra-Magnet Assisted Transfectionデモ受付 IBA社独自の磁性ナノ粒子（MagTag®）を用いた、トランスフェクション試薬のデモを受付いたします。初代培養細胞や神経細胞など、導入困難な細胞に高効率での導入ができると高い評価を頂いています。是非この機会をご利用ください。

期　　　間：2010年8月16日(月)～9月24日(金)

デモ内容：試薬はデモ用包装をご購入いただきます。磁気プレー トは1週間貸し出します。使用結果をお知らせいただきます。

 

デモのお申し込みはこちらまで。ｐｄｆ（464ＫＢ）

 

 

 

試薬はただいまキャンペーン中です。

 

 

 

製品の詳細情報はこちら。Information-441-light.ｐｄｆ（1516KB）

 

]]> http://www.nacalai.co.jp/update/iba_matra-magnet_assisted_transfection.html http://www.nacalai.co.jp/update/iba_matra-magnet_assisted_transfection.html Mon, 09 Aug 2010 10:54:14 +0900 LabFab News Vol.8 August を発行しました。 https://www.nacalai.co.jp/ss/Contact/news.cfm https://www.nacalai.co.jp/ss/Contact/news.cfm Mon, 09 Aug 2010 10:40:45 +0900 IBA社 MATra-Magnet Assisted Transfection デモキャンペーン

ご好評いただいています磁性ナノ粒子を用いたトランスフェクション試薬について、デモ＆特別価格でご提供のキャンペーンを実施します。是非この機会をご利用ください。製品の詳細は、

Information-441-light.pdf(1,516KB）をご参照ください。

 
デモおよびキャンペーン期間：2010年8月16日(月)～9月24日(金) 

キャンペーン内容：希望納入価格の25%off
]]> http://www.nacalai.co.jp/products/campaign/iba_matra-magnet_assisted_transfection.html http://www.nacalai.co.jp/products/campaign/iba_matra-magnet_assisted_transfection.html キャンペーン情報 Fri, 06 Aug 2010 17:26:18 +0900 Olink Bioscience社Duolink™ in situ PLA Olink Bioscience社　Duolink® in situ PLA™

Olink Bioscience社

Olink Bioscience社（スウェーデン）は、1分子レベルでターゲットタンパク質を特異的に検出する独自の増感技術(PLA: Proximity Ligation Assay)を有しています。
PLA法は高感度な検出が可能なだけでなく、使用する一次抗体の選択により、細胞や組織の内在性タンパク質の相互作用や局在、翻訳後修飾などを検出できる画期的な検出方法です。
今回、このPLA法を利用したDuolink® が新製品のDuolink® IIとなり、さらにパワーアップしました。旧製品のDuolink®システムと比べプロトコールが短縮され、S/N比も向上してい ます。
注）掲載のデータはすべて旧製品のDuolink®で取得したものです。

特長

  • 内在性タンパク質の二分子間相互作用や局在、翻訳後修飾などの解析が可能
  • 検出しにくい内在性タンパク質の検出も可能
  • 検出されたドットをカウントすることで、定量的な発現・相互作用解析が可能

 

| 使用例1.Olink社　Duolink®　in situ  PLATM を用いたFOXO1と14-3-3の相互作用局在解析法 | 原理  | Duolink®のアプリケーション | 使用例2.二分子間相互作用の検出| 使用例3.りん酸化タンパク質の検出  | 使用例4.タンパク質発現の検出と定量(Single Recognition法)　|　使用例5.タンパク質発現の検出と定量(Single Recognition法)-2 | 使用例6.タンパク質発現の検出と定量(Double Recognition法)　|　発色検出法 | 製品選択 | 新旧製品対比表| 関連製品 |　文献 |　Q＆A | 価格表 |

使用例1

Olink社　Duolink　in situ  PLATM を用いたFOXO1と14-3-3の相互作用局在解析法

 11_28.jpg 11_29.jpg
実験概要 
 血清存在下において、転写因子FOXO1は細胞質に局在し、アダプタータンパク質14-3-3と結合しているが（図C）、PI3K阻害剤LY294002の添加により、FOXO1は14-3-3タンパク質から解離し、核移行することが知られている（図D）。本実験では、Duolink® in situ PLATM を用いて、LY294002処理前後における両者の結合状態の変化をモニターした。
11_30.jpg 11_31.jpg
実験方法
細胞： HEK293 cell
固定条件： 4% PFA
一次抗体： FOXO1（C29H4） Rabbit mAb （Cell Signaling Technology 製品番号 2880）
pan 14-3-3（H-8） Mouse mAb （Santa Cruz 製品番号 sc-1657）
Duolink® の組み合わせ：
  Duolink®  PLATM probe anti-Mouse MINUS
Duolink®  PLATM probe anti-Rabbit PLUS
Duolink®  Detection Kit 613
顕微鏡： Fluoview FV10i （オリンパス）
結果・考察
Duolink® in situ PLATM を用いて、FOXO1および14-3-3の結合を検出したところ、すでに報告されているとおり血清存在下では、両者の結合が細胞質で検出され（図A）、LY294002の添加により両者の結合が減少した（図B）ことが明らかとなった。

データご提供：筑波大学大学院　生命環境科学研究科　生物機能科学専攻 吉用　賢治　学振特別研究員／大徳　浩照　講師／深水　 昭吉　教授

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原理

PLA（Proximity Ligation Assay）法

PLA法の原理について二分子間相互作用を検出する場合を基にご紹介します。まず、相互作用している2種類のタンパク質にそれぞれを検出する一次抗体*1を作用させます。ただし、用いる2種類の抗体は、免疫動物種（mouse、rabbit、goat）が異なっていなければなりません*2。次に、一次抗体の免疫動物種に対応した二次抗体のセットを作用させます。二次抗体には特殊な核酸が連結しており、二つの異なる二次抗体同士が近接（約40nm）した場合に核酸のライゲーション反応が生じ、環状構造を形成します。さらに、ポリメラーゼを反応させることにより、環状構造に沿って一本鎖の核酸を伸長させます。伸長させる核酸内には特定の
リピート配列が組み込まれるようになっており、蛍光標識またはHRP標識*3された相補的な核酸が、その配列へハイブリダイゼーションします。以上の方法により2種のタンパク質の相互作用を検出します。 

 11_32.jpg図1.一次抗体と二次抗体の結合

サンプルをブロッキングした後、検出目的のタンパク質を検出する免疫動物の異なる2種類の一次抗体*2をサンプル（組織、細胞等）とインキュベーションします。
次にDuolink® II PLA probe　MINUSおよびDuolink® II PLA probe PLUS (オリゴヌクレオチドを連結した二次抗体)溶液を添加後インキュベーション（37℃、60分）します。

11_33.jpg 図2.PLAプローブのハイブリダイズとライゲーション反応

2種類のオリゴを含有しているLigation solutionを添加し、インキュベーション（37℃、30分）することで、環状構造が形成されます。

 11_34.jpg 図3.伸長反応と標識プローブのハイブリダイズ

Amplification solutionを添加し、インキュベーション（37℃、100分）すると、環状構造に沿って一本鎖の核酸が伸長されます（RCA法）。この反応液には蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブが含まれており、伸長した核酸へハイブリダイズします。HRP標識されたプローブを用いて発色基質を使用して、光学顕微鏡(明視野)で検出するシステムもあります。

  11_35.jpg図4.封入剤処理と解析
 Duolink® II Mounting Medium with DAPI (別売り： 82040-0005)でサンプルを封入した後、蛍光顕微鏡で解析します。

 

*1 一次抗体はお客様でご用意ください。Single Recognition法の場合、1種類の一次抗体を作用させます。
*2 Probemakerを使用することで同じ免疫動物種由来の抗体でも使用可能になります。
*3 HRP標識された核酸を用いる場合、HRPに対する発色基質を用いて検出します。

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Duolink®のアプリケーション

二分子間相互作用の検出
二分子間相互作用の検出
＜方法＞
それぞれのターゲットタンパク質に結合する2種類の一次抗体を使用

＜アプリケーション例＞
・タンパク質相互作用を検出
・複合体の局在を検出

二分子間相互作用の検出
詳細はこちら
SMAD1/2/3とSMAD4に対する2種類の一次抗体と 本システムを使用して検出（オレンジ色のドット）、サンプル：マウス胎児線維芽細胞をTGF-βで刺激後、検出
りん酸化タンパク質の検出
りん酸化タンパク質の検出
＜方法＞
一次抗体の一方にターゲットタンパク質のりん酸化部位を認識する抗体を使用

＜アプリケーション例＞
・翻訳後修飾タンパク質を検出
・翻訳後修飾タンパク質の局在を検出

りん酸化タンパク質の検出
詳細はこちら
phospho-PDGFとPDGF-β受容体 に対する2種類の一次抗体と本システムを使用して検出（赤色のドット）、サンプル：BJ hTert細胞をPDGF-BBで刺激後、検出
タンパク質発現の検出（Single Recognition）
高感度検出
＜方法＞
1つのターゲットタンパク質に対し、エピトープの異なる2種類の一次抗体を使用

＜アプリケーション例＞
・タンパク質局在を検出

高感度検出
詳細はこちら
EGFRに対する1種類の一次抗体と本システムを使用
して検出（赤色のドット）、サンプルA431細胞
タンパク質発現の検出（Double Recognition）
 
高特異性・高感度検出
＜方法＞
1つのターゲットタンパク質に対し、エピトープの異なる2種類の一次抗体を使用

＜アプリケーション例＞
・タンパク質局在を検出
 

高特異性・高感度検出

詳細はこちら
HER2に対する2種類の一次抗体と本システムを使用して検出（オレンジ色のドット）、サンプル：MDA175細胞

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その他の検出法との比較

本システムは、従来のFRET/BRETなどの蛍光ベースのタンパク質相互作用解析や共免疫沈降法と異なり、細胞や組織など多様なサンプルについて、内在性タンパク質の相互作用、局在化など様々な情報を一度に得ることが可能です。

Objective\Technique Duolink® in situ PLATMCo-localizationCo-immunoprecipitationBRETFRET
Detect single molecules check         
Detect in situ check  check   check  check
Study endgenous proteins check  check  check    
Analyze protein interaction check   check check check  check
Analyze archived tissue check  check      
Obtain objective,
quantifiable result		 check        

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使用例2

二分子間相互作用の検出

SMAD1/2/3-SMAD4の相互作用解析
SMAD1/2/3-SMAD4の相互作用解析
蛍光染色データとイメージ解析

上段のデータ(A, B)は、本システムを使用しマウス胎児線維芽細胞をTGF-βで未刺激(A)と45分間刺激(B)したサンプルに関する検出結果を示している。SMAD1/2/3（マウス由来）*)とSMAD4（ラビット由来）に対する一次抗体と本システムを用いて検出されたシグナルは、オレンジ色のドットで示されている。核はHoechst 33342（青色）、アクチンはFITC-抗アクチン抗体（緑色）で染色されている。
下段のデータ(C, D)は、上段のデータをMatlab image analysis softwareを用いて、イメージ解析したデータを示している。
TGF-β刺激を行ったサンプルは、SMAD1/2/3とSMAD4の相互作用が生じ、複合体が核に移行することが示されている（図中の白色のドット）。
*)マウス由来のSMAD1/2/3と交差するヒト由来完全長SMAD-1を抗原とした一次抗体を使用しました。

＜使用した検出システム＞
  • Duolink® in situ PLATM probe anti-mouse MINUS
  • Duolink® in situ PLATM probe anti-rabbit PLUS
  • TexasRed®標識されたプローブ（Ex/Em：583/603)
SMAD1/2/3-SMAD4の相互作用解析
核と細胞質における相互作用の比較

SMAD1/2/3-SMAD4相互作用を表すシグナルの数をカウントし、核と細胞質のそれぞれに分類しグラフにプロットした。65個のTGF-β未刺激の細胞（■）と60個の刺激した細胞（▲）が解析された。このデータによりTGF-βで刺激した細胞は、SMAD1/2/3-SMAD4複合体が核に移行することが示されている。
HER2-EGFRの相互作用解析
HER2-EGFRの相互作用解析
蛍光染色データとイメージ解析

本システムを使用しSK-BR-3細胞における、HER2-EGFRの相互作用を検出した結果を示している。左側のデータ(A)は、HER2に対する一次抗体（ラビット由来）、phospho-EGFRに対する一次抗体（ヤギ由来）と本システムを用いて検出されたシグナルの画像（赤色のドット（575/605 Filter使用））と青色で染色される核の染色画像（Hoechst 350/461 Filter使用）を重ね合わせたデータである。データ中の数字は、細胞集団の中で任意に付けた数字である。右側のデータ（B）は、BlobFinder*)イメージ解析プログラムを用いて計測されており、本システムにより検出されたシグナル（白色のドット）は、細胞とバックグラウンドの双方に起因している。核の周辺部分（緑色の縁取り）の任意の部分（黄色と緑色の間の部分）で検出されているシグナルは細胞に起因していることを示す一方、境界線の外側および核に近接してないシグナルは、バックグラウンドに起因している。

＜使用した検出システム＞
  • Duolink® in situ PLATM probe anti-mouse MINUS
  • Duolink® in situ PLATMprobe anti-goat PLUS
  • TexasRed®標識されたプローブ（Ex/Em：583/603）

*)BlobFinderは機能アップしDuolink® ImageToolとして販売しています。

使用例3

りん酸化タンパク質の検出

内在性レベルのPDGF受容体-βのりん酸化レベルの検出
内在性レベルのPDGF受容体-βのりん酸化レベルの検出
蛍光染色データ

本システムを使用しBJ hTert細胞をPDGF-BB未刺激（A）と60分間刺激（B）したサンプルに関する検出結果を示している。phospho-PDGF(マウス由来)とPDGF受容体-β(ラビット由来)に対する一次抗体と本システムを用いて検出されたシグナルは、赤色のドットで示されている。核はHoechst 33342(青色)で染色されている。本システムを使用することで、内在性タンパク質のりん酸化レベルを比較検討できることを示している。

＜使用した検出システム＞
  • Duolink® in situ PLATM probe anti-mouse MINUS
  • Duolink® in situ PLATM probe anti-rabbit PLUS
  • TexasRed® 標識されたプローブ（Ex/Em：583/603

細胞1個あたりのりん酸化のレベルとその集団の割合

細胞1個あたりのりん酸化のレベルとその集団の割合

1個の細胞あたりのりん酸化された受容体の数

PDGF受容体-βのりん酸化の定量について、BlobFinderソフトウェアにより、239個の未刺激の細胞と275個のPDGF-BB刺激処理を行った細胞のヒストグラム。刺激に応じて、りん酸化された受容体のレベルが上昇することが示されています。

 

 

 

*)BlobFinderは機能アップしDuolink® ImageToolとして販売しています。

使用例4

タンパク質発現の検出と定量(Single Recognition法)

siRNA効果の検出への応用
siRNA効果の検出への応用（高感度検出） 
SMAD4の発現抑制の検出

マウス胎児線維芽細胞におけるSMAD4に対するsiRNAの発現抑制を示している。SMAD4に対して、siRNAを添加した場合（A）と未処理の場合（B）におけるSMAD4の発現を本システムにより検出したデータである。一次抗体は、マウス由来のSMAD4抗体を用いた。1分子レベルで検出されたSMAD4は、赤色のドットとして検出されている。核はHoechst 33342（青色）で染色されている。

＜使用した検出システム＞
  • Duolink® in situ PLATM probe anti-mouse MINUS
  • Duolink® in situ PLATM probe anti-mouse PLUS
  • Detection kit 563 (Ex/Em：557/563)
1個の細胞あたりの検出シグナル数の比較
1個の細胞あたりの検出シグナル数の比較

データはsiRNAを添加した場合と未処理の場合の細胞1個あたりのシグナルの数を示している。
siRNAを添加した細胞では、シグナルの数が1～10個と減少しており、本システムによりsiRNAの効果を検出できることを示している。
11-37.jpg
ウェスタンブロッティングの結果との相関

siRNAを添加した場合（A）と未処理の場合(B)の細胞をそれぞれ回収し、ウェスタンブロッティング解析を行った結果を示している。
Duolink®の検出結果とウェスタンブロッティングの検出結果は相関性がある事を示している。

  

  

siRNA研究におけるDuolinkTM の利点

方法正確な定量性タンパク質発現
レベルでの検出		局在化解析1個の細胞レベル
での解析		微量サンプル
への適応
Real-time PCR ○ × × × ×
ウェスタン
ブロッティング		 ○ ○ × × ×
免疫染色 × ○ ○ ○ ○
DuolinkTM システム ○ ○ ○ ○ ○
Duolink® システムは、1個の細胞についてタンパク質レベルで解析できることから、従来のsiRNAの評価方法と比較し、微量のサンプルから様々な情報を得ることが可能です。

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使用例5

タンパク質発現の検出と定量(Single Recognition法)

EGFRに対する従来の免疫組織染色法との比較
サンプル（一次抗体あり） コントロール（一次抗体なし）
EGFRに対する従来の免疫組織染色法との比較

一次抗体として、マウス由来のEGFR抗体を用い、本システム（A）と従来の免疫蛍光染色(C)の結果を比較している。従来の免疫蛍光染色には、ロバ由来のTexasRed® 標識抗マウスIgG抗体を二次抗体として用いた。サンプルはA431細胞を用いている。これらの結果から、本システムを用いたサンプルはタンパク質を1分子レベルでドット検出され定量化可能である。一方、従来の免疫蛍光染色は、シグナルが拡散し1分子レベルで検出不可能である。また、コントロールに関しても、本システムを用いた場合(B)は、バックグラウンドシグナルが検出されないが、従来の免疫染色法（D）では検出されている。

＜使用した検出システム＞
  • Duolink® in situ PLATM probe anti-mouse MINUS
  • Duolink® in situ PLATM probe anti-mouse PLUS
  • Detection kit 613(Ex/Em：598/613)

使用例6

タンパク質発現の検出と定量(Double Recognition法)

2種類の抗体を用いたHER2の検出
蛍光染色データ
11-38.jpg

HER2抗体（マウス由来、ラビット由来の2種類の一次抗体）を用いた本システムの使用結果を示している。HER2に対する一次抗体と本キットを用いて検出されたシグナルは、オレンジ色のドットとして検出されている。サンプルは、MDA175細胞（+1レベル）を用いた。 

 ＜使用した検出システム＞
  • Duolink® in situ PLATM probe anti-mouse MINUS
  • Duolink® in situ PLATM probe anti-rabbit PLUS
  • Detection kit 563 (Ex/Em：557/563)

 

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発色検出法

光学顕微鏡観察

　Duolink®　II Detection Reagents Brightfield

本製品は検出プローブがHRP標識されており、発色基質を使用することで、光学顕微鏡(明視野)を
用いて、ターゲットタンパク質の相互作用や局在等を解析することができます。

11-39.jpg

上臓がん組織(A)と健常な肝臓組織(B)をサンプルとしてHER受容体を検出した（茶褐色のドット）。この結果は、がん組織でHER受容体が多く発現していることを示している。

＜使用した検出キット＞
  • Duolink® Detection kit HRP/NovaRED

製品選択

本システムでは、Probe MINUS、Probe PLUS、Detection Reagentsが必要となります。Probe MINUSとProbe PLUSは各3種×2容量、Detection Reagentsは3種×2容量のラインアップになっています。各々からお客様の実験に適したものを1種ずつお選びください。容量はそれぞれ30回用と100回用の2容量があります。

11-36.jpg

＊旧バージョンのPLA probeとDuolink® II Detection Reagentsの組み合わせ、または、Duolink® II PLA probeと旧バージョンのDetection kitの組み合わせでは、使用することができませんのでご注意ください。

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新旧製品対比表

Duolink®  Duolink® II
Duolink® PLATM probe anti-Mouse PLUS → Duolink®  II PLATM probe anti-Mouse PLUS
Duolink® PLATM probe anti-Rabbit PLUS → Duolink®  II PLATM probe anti-Rabbit PLUS
Duolink® PLATM probe anti-Goat PLUS → Duolink®  II PLATM probe anti-Goat PLUS
Duolink® PLATM probe anti-Mouse MINUS → Duolink®  II PLATM probe anti-Mouse MINUS
Duolink® PLATM probe anti-Rabbit MINUS → Duolink®  II PLATM probe anti-Rabbit MINUS
Duolink® PLATM probe anti-Goat MINUS → Duolink®  II PLATM probe anti-Goat MINUS
Mouse、Rabbit、Goat以外のPLATM probe anti-X PLUS → 抗体 + Duolink® II Probemaker PLUS
＊Duolink® II Probemakerは抗体にプローブを標識するキットです。標識される抗体は別途ご用意ください。
Mouse、Rabbit、Goat以外のPLATM probe anti-X MINUS → 抗体 + Duolink® II Probemaker MINUS
＊Duolink® II Probemakerは抗体にプローブを標識するキットです。標識される抗体は別途ご用意ください。
Duolink® Detection kit 563 → Duolink®  II Detection Reagents Orange
Duolink® Detection kit 613 → Duolink®  II Detection Reagents Red
Duolink® Detection kit HRP/NovaRED → Duolink®  II Detection Reagents Brightfield
Duolink® Mounting Medium → Duolink®  II Mounting Medium with DAPI
→ Duolink®  Mounting Medium
＊本製品を使用した場合は核が染色されません。
Duolink® Brightfield Mounting Medium → Duolink® Brightfield Mounting Medium
Duolink®  Wash Buffer → Duolink®  II Wash Buffers for Fluorescence
＊Duolink® II Detection Reagents Orange/Red用のバッファーでWash BufferAとBで構成されています。
→ Duolink®  II Wash Buffer A
→ Duolink®  II Wash Buffer B
＊Duolink® II Detection Reagents Brightfield では使用しません。
Duolink® Control Kit → Duolink®  II ControlKit
- → Duolink®  ImageTool

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関連製品

Duolink® II Probemaker

本製品を用いて直接一次抗体へPLA probe (MINUSとPLUS)を連結することができます。これにより、Duolink® II PLA probe のラインアップに目的の製品が無い場合、ホモダイマーを検出する場合、用いる2種類の一次抗体が同じ免疫動物の場合でもDuolink® II Detection Reagentsを使用することができます。

Duolink® II Probemaker使用後のPLA法

 

  11_40.jpg 図1.PLA probe連結一次抗体の目的タンパク質への結合

サンプルをブロッキングした後、PLA probeが連結した一次抗体（MINUSとPLUS）をサンプル（組織、細胞等）とインキュベーションします。

 

 

  11_37.jpg 図2.PLAプローブのハイブリダイズとライゲーション反

2種類のオリゴを含有しているLigation solutionを添加し、インキュベーション（37℃、30分）することで、環状構造が完成します。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　  

 

  11_38.jpg図3.伸長反応と標識プローブのハイブリダイズ 

Amplification solutionを添加し、インキュベーション（37℃、100分）すると、環状構造に沿って一本鎖の核酸が伸長されます（RCA法）。この反応液には蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブが含まれており、伸長した核酸へハイブリダイズします。HRP標識されたプローブを用いて発色基質を使用して、光学顕微鏡(明視野)で検出するシステムもあります。注意）本製品はPLA probe連結抗体を作成するためのキットです。別途Duolink® II Detection Reagentsが必要です。

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Duolink® ImageTool

 本製品は、Duolink®システムを用いて得られた実験結果の画像処理、およびその結果の数値化が行えます。解析後、数値データはExcel等で使用できるテキストファイルとして、画像はTIF、JPEG、PNG、BMPファイルとして出力できます。
また、Olink社では本製品のデモバージョンを用意しており、下記のURLよりダウンロードが可能です。
http://www.olink.com/downloads/readpdf.php?menu=432
本デモバージョンには、機能制限が設けられています。機能制限の無いフルバージョンでのデモをご希望される場合は出張デモも可能です。販売店または弊社営業所までご連絡ください。

11_39.jpg

 

 

 

 

 

 

   対応OS：
　Windows®  XP
　Windows Vista®
　Windows®  7

 

 

・自動で核を検出し、核の数、核の面積、シグナル強度を測定
・各細胞あたりのシグナル数を計測

 

 

 

 

 

 

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文献

Duolink® in situ PLATM 使用文献（一部）
二分子間相互作用の検出・定量
1.　Wilhelm, M. et al. Isoform-specific p73 knockout mice reveal a novel role for delta Np73 in the DNA damage response pathway. Genes Dev. 24(6), 549-60 (2010).
2. 　Nilsson, I. et al. VEGF receptor 2/-3 heterodimers detected in situ by proximity ligation on angiogenic sprouts. EMBO J. 29(8), 1377-88 (2010).
3.　Liu, B. et al. The polarisome is required for segregation and retrograde transport of protein aggregates. Cell. 140(2), 257-67 (2010).
4.　Kii, I. et al. Incorporation of tenascin-C into the extracellular matrix by periostin underlies an extracellular meshwork architecture. J Biol Chem. 285(3), 2028-39 (2010).
5.　Robinson, S. et al. αvβ3 Integrin Limits the Contribution of Neuropilin-1 to Vascular Endothelial Growth Factor-induced Angiogenesis. J Biol Chem. 284(49), 33966-81 (2009).
6.　Yamazaki, T. et al. COUP-TFII regulates the functions of Prox1 in lymphatic endothelial cells through direct interaction. Genes Cells. 14(3), 425-434 (2009).
7.　Greenberg, J. I. et al. A role for VEGF as a negative regulator of pericyte function and vessel maturation. Nature. 456(7223), 809-813 (2008).
りん酸化タンパク質（翻訳後修飾）の検出・定量
1.　Nakakuki, T. et al. Ligand-specific c-Fos expression emerges from the spatiotemporal control of ErbB network dynamics. Cell, 141(5), 884-96 (2010)
2.　Vetterkind, S. et al. Par-4: a new activator of myosin phosphatase. Mol. Biol. Cell, 21(7), 1214-24 (2010).
3.　Leuchowius, K. J. et al. High content screening for inhibitors of protein interactions and post-translational modifications in primary cells by proximity ligation. Mol Cell Proteomics. 9(1), 178-83 (2010).
4.　Conze, T. et al. MUC2 mucin is a major carrier of the cancer-associated sialyl-Tn antigen in intestinal metaplasia and gastric carcinomas. Glycobiology. 20(2), 199-206 (2010).
5.　Koos, B. et al. Platelet-derived growth factor receptor expression and activation in choroid plexus tumors. Am J Pathol. 175(4), 1631-1637 (2009).
6.　Leuchowius, K. J. et al. Flow cytometric in situ proximity ligation analyses of protein interactions and post-translational modification of the epidermal growth factor receptor family. Cytometry A. 75(10), 833-839 (2009).
7.　Matsumoto, T. et al. Ninein is expressed in the cytoplasm of angiogenic tip-cells and regulates tubular morphogenesis of endothelial cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28(12), 2123-2130 (2008).
タンパク質発現の検出・定量（Single Recognition）
1.　Yadav, A. K. et al. Monosomy of chromosome 10 associated with dysregulation of epidermal growth factor signaling in glioblastomas. JAMA. 302(3), 276-289 (2009).
タンパク質発現の検出・定量（Double Recognition）
1.　Hasumi, Y. et al. Homozygous loss of BHD causes early embryonic lethality and kidney tumor development with activation of mTORC1 and mTORC2. Proc Natl Acad Sci U S A. 106(44), 18722-18727 (2009).
PLA技術に関連する主な文献
1.　Jarvius, M. et al. Detection of PDGF-receptor-ß phosphorylation using a generalized P-LISA method. Molecular & Cellular Proteomics. 6(9), 1500-1509 (2007).
2.　Söderberg, O. et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3(12), 995-1000 (2006).
3.　Gullberg, M. et al. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proc Natl Acad Sci U S A. 101(22), 8420-8424 (2004).
4.　Fredriksson, S. et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnol. 20, 473-477 (2002).

Duolink Assay Database(http://www.olink.com/downloads/readpdf.php?menu=432)今までに使用された抗体やサンプル、そしてターゲットやアッセイ条件等が一覧になっています。参考情報としてご覧ください。

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Q＆A

Single Recognition法とDouble Recognition法の違いは何ですか？
Single Recognition法では1種類の一次抗体を使用して高感度検出が可能です。一方、Double Recognition法では2種類の一次抗体を使用して特異性の高い検出が可能です。
Duolink® システムの使用条件はありますか？
本システムは免疫染色で機能する一次抗体が必要です。加えて、事前に一次抗体が機能する条件を確定しておく必要があります。
どのようなサンプルで使用できますか？
本システムは、固定した細胞やホルマリン固定パラフィン包埋した組織等の様々なサンプルに使用可能です。
生細胞で使用することはできますか？
本システムは固定化処理をしたサンプルを対象としていますので、生細胞では使用することができません。
生細胞で使用することはできますか？ 
 本システムは固定化処理をしたサンプルを対象としていますので、生細胞では使用することができません。
サンプルの前処理で制約はありますか？
抗原の賦活化は、一般的な熱処理とProteinase Kを用いた処理法で問題ありません。固定化は、パラホルムアルデヒド、ホルマリン、亜鉛、エタノール、アセトンなどを用いる様々な方法が適用可能です。
自前のブロッキング溶液は使用できますか？
免疫染色で現在使用されているブロッキング溶液を本システムでも使用して頂けます。一次抗体の使用において、特にブロッキング溶液が限定されていない場合は、製品添付のブロッキング溶液をご使用ください。
退色防止剤は何を使用すればいいですか？
Duolink® II Mounting Medium with DAPIをご用意しています。旧バージョンのMounting Mediumでは核が染色されませんのでご注意ください。
洗浄バッファーは何を使用すればいいですか？
マニュアルに従って作製して頂くか、製品（Duolink® II Wash Buffer）をご購入ください。旧バージョンの洗浄バッファーは使用しないでください。
PLA 標識二次抗体について教えてください
体の免疫動物はDonkeyです。PLA probe anti-MouseはRat IgGと交差性がありますのでご注意ください。
また、Duolink® IIでは、旧バージョンのPLA probeはご利用できませんのでご注意ください。
ヘテロダイマーの検出で注意することはありますか？
各タンパク質に用いる一次抗体は宿主が異なるものを使用してください。
同じ宿主由来の抗体を用いる場合はDuolinkr® II Probemakeをご利用ください。
ホモダイマーの検出はできますか？

下記2種類の方法で検出できます。

1) 1種類の一次抗体をDuolink® II Probemaker を用いてMINUSとPLUSそれぞれで標識する。

2) 同じエピトープを認識するが宿主の異なる2種類の一次抗体を使用する。この場合は特異性の高い抗体で最適化（一方の抗体の結合量が過剰とならないような濃度の条件検討）する必要があります。
サンプル由来の核酸へ標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズしませんか？
可能性はありますが、RCA法により増幅された核酸に比べて、サンプル由来の核酸へハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチドのシグナル強度は非常に弱いと考えられることから問題ありません。

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価格表

製品名メーカー
製品番号		容量価格
PLATM probe anti-X MINUS
Duolink®  II PLATM probe anti-Mouse MINUS 92004-0030 30 reactions 49,000
92004-0100 100 reactions 86,000
Duolink®  II PLATM probe anti-Rabbit MINUS 92005-0030 30 reactions 49,000
92005-0100 100 reactions 86,000
Duolink®  II PLATM probe anti-Goat MINUS 92006-0030 30 reactions 49,000
92006-0100 100 reactions 86,000
PLATM probe anti-X PLUS
Duolink®  II PLATM probe anti-Mouse PLUS 92001-0030 30 reactions 49,000
92001-0100 100 reactions 86,000
Duolink®  II PLATM probe anti-Rabbit PLUS 92002-0030 30 reactions 49,000
92002-0100 100 reactions 86,000
Duolink®  II PLATM probe anti-Goat PLUS 92003-0030 30 reactions 49,000
92003-0100 100 reactions 86,000
Detection Reagents
Duolink®  II Detection Reagents Orange 92007-0030 30 reactions 65,000
92007-0100 100 reactions 115,000
Duolink®  II Detection Reagents Red 92008-0030 30 reactions 65,000
92008-0100 100 reactions 115,000
Duolink®  II Detection Reagents Brightfield  劇　　　　 92012-0030 30 reactions 105,000
92012-0100 100 reactions 155,000
関連製品」
Duolink®  II Probemaker MINUS＊ 92010-0020 20 μg 86,000
Duolink®  II Probemaker PLUS＊ 92009-0020 20 μg 86,000
Duolink®  II Mounting Medium with DAPI 82040-0005 5　ml 40,000
Duolink®  Brightfield Mounting Medium 82049 1 set 11,000
Duolink®  II Wash Buffer A 82047-0010 1 set 21,000
Duolink®  II Wash Buffer B 82048-0010 1 set 36,000
Duolink®  II Control Kit

92011

 1 kit 97,000
Duolink®  ImageTool

90806

 1 each

180,000

*各Probemakerは20μgの抗体を標識することができます。＃82049はDuolink® II Wash Buffer Aが3袋とDuolink® II Wash Buffer Bが1袋で構成されています。発色検出法 (Brightfield)で使用するバッファーはDuolink® II Wash Buffer Aのみです。

＜商標について＞
Olink®  、Duolink®：Olink ABの登録商標
PLATM ：Olink ABの商標
NovaREDTM  ：Vector Laboratoriesの商標
TexasRed®  ：Life Technologies Corporationの登録商標
Windows® 、Windows Vista® ：マイクロソフトの登録商標

 

 

※掲載の内容は、'10年08月現在の情報に基づいております。  

]]> http://www.nacalai.co.jp/products/recommend/olink2.html http://www.nacalai.co.jp/products/recommend/olink2.html おすすめ製品 Tue, 27 Jul 2010 11:56:10 +0900 Duolink®　はDuolink® IIへバージョンアップキャンペーン

Olink Bioscience社のDuolink® がバージョンアップして新登場しました。プロトコールが短縮され、S/N比も向上しています。

詳細は、

Information-406-6.pdfをご参照ください。

 

 

旧製品は2010年12月末までの販売予定です。①旧製品から新製品への切り替え検討、②現在のお仕事がひと段落つくまでの追加購入、③バージョンアップされたこの機会に新規採用の検討のお役に立つように特別価格でのご提供キャンペーンを実施します。是非この機会をご利用ください。


期間：2010年8月2日(月)～9月24日(金) 
内容：新製品 希望納入価格の30%off
旧製品 希望納入価格の50%off
注文書でご注文の場合に、キャンペーン価格でご提供します。
pdf.gif 注文書pdfファイル（990KB）
]]> http://www.nacalai.co.jp/products/campaign/duolinkduolink_ii.html http://www.nacalai.co.jp/products/campaign/duolinkduolink_ii.html キャンペーン情報 Mon, 26 Jul 2010 17:24:21 +0900