COSMOSIL

COSMOSIL カラムによる糖質の分析例のご紹介

COSMOSIL カラムで分析した分析例の一部、今回は糖質の分析例を紹介します。この他にも多くの分析例を用意しています。
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食品の主成分は、炭水化物・脂質・タンパク質・ビタミン・無機質などがあげられます。その中で炭水化物は、エネルギー源として重要であり基本的な化学構造は糖類で構成されています。
糖質は、揮発性が乏しくガスクロマトグラフィーでは分析が難しい化合物群であり、液体クロマトグラフィーが汎用的に用いられます。糖質は、分析対象に応じて分離モードを使い分けることにより高速液体クロマトグラフィー (HPLC)で分析が可能となります。各種糖質の推奨カラムによる分析例について紹介します。

分類 1分類 2例推奨 HPLC カラム
単糖・二糖類 グルコース Sugar-D
誘導糖質 乖離基を有する りん酸化糖 HILIC
乖離基を持たない 糖アルコール Sugar-D
オリゴ糖 トレハロース Sugar-D
多糖 ヒアルロン酸 Diol-Ⅱシリーズ
多糖の分解物 酵素分解物 C18-MS-Ⅱなど C18 シリーズ / Cholester
配糖体 分子量 2,000 未満の低分子の配糖体 カテキン類 C18-MS-Ⅱなど C18 シリーズ / Cholester
分子量 2,000 以上の高分子の配糖体 糖タンパク質 Protein-R などタンパク質分離用カラム

1. 単糖・二糖類の分析

単糖や二糖類を分析するために最適な HPLC カラムとしてコスモシール Sugar-D があります。Sugar-D は、定量性・耐久性に優れた糖分離用カラムです。

清涼飲料などに多く含まれる糖類

AP-0326.png

Conditions
Column COSMOSIL Sugar-D
4.6 mm I.D. × 250 mm
Mobile phase Acetonitrile / H2O = 75 / 25
Flow rate 1.0 mL/min
Tempera ture 30℃
Detection RI
Sample
  1. D‐(-)‐Fructose (10 µg)
  2. D-(+)-Glucose (10 µg)
  3. Sucrose (10 µg)
  4. Maltose (10 µg)

チョコレートなどに多く含まれる糖類

AP-0324.png

Conditions
Column COSMOSIL Sugar-D
4.6 mm I.D. × 250 mm
Mobile phase Acetonitrile / H2O = 75 / 25
Flow rate 1.0 mL/min
Tempera ture 30℃
Detection RI
Sample
  1. Sucrose (10 µg)
  2. Lactose (10 µg)

ガムなどに含まれる糖類・糖アルコール類

AP-0323.png

Conditions
Column COSMOSIL Sugar-D
4.6 mm I.D. × 250 mm
Mobile phase Acetonitrile / H2O = 75 / 25
Flow rate 1.0 mL/min
Tempera ture 30℃
Detection RI
Sample
  1. meso-Erythritol[meso-Erythrite] (10 µg)
  2. Xylitol (10 µg)
  3. Palatinose (10 µg)
  4. Maltitol (10 µg)

スポーツ飲料などに多く含まれる糖類

AP-0327.png

Conditions
Column COSMOSIL Sugar-D
（4.6 mm I.D. × 250 mm）× 2
Mobile phase Acetonitrile / H2O = 75 / 25
Flow rate 1.0 mL/min
Tempera ture 50℃
Detection RI
Sample
  1. meso-Erythritol[meso-Erythrite] (10 µg)
  2. D‐(-)‐Fructose (10 µg)
  3. D-Glucitol (10 µg)
  4. D-(+)-Glucose (10 µg)
  5. Sucrose (10 µg)
  6. Maltose (10 µg)
  7. Maltotriitol (10 µg)
  8. Maltotriose (10 µg)

2. 誘導糖質の分析

誘導糖質には、りん酸化糖のように乖離基を有する糖質と、糖アルコールのように乖離基を持たない糖質とがあります。

（1）乖離基を持つ化合物（りん酸化糖など）

乖離基を持つ糖質は、コスモシール HILIC を用いることにより再現性のよい分析ができます。糖分離用カラムコスモシール Sugar-D においても分析は可能ですが、用いる緩衝液により再現性が低下する場合があります。

りん酸化糖類

AP-0317.png

Conditions
Column COSMOSIL HILIC
4.6 mm I.D. × 250 mm
Mobile phase Acetonitrile / 20 mmol/L Phosphate Buffer(pH 7.0) = 60 / 40
Flow rate 1.0 mL/min
Tempera ture 30℃
Detection RI
Sample
  1. D‐Fructose‐6‐Phosphate (50 µg)
  2. D-Glucose-6-Phosphate (50 µg)

D-グルクロン酸

H00030.png

Conditions
Column COSMOSIL HILIC
4.6 mm I.D. × 250 mm
Mobile phase Acetonitrile / 10 mmol/L Phosphate Buffer(pH 7) = 50 / 50
Flow rate 1.0 mL/min
Tempera ture 30℃
Detection UV 210 nm
Sample

D-Glucuronic Acid (10.0 mg/mL)
Inj. Vol. 1.0 µL

（2）乖離基を持たない化合物（糖アルコールなど）

乖離基を持たない糖アルコールなどの化合物に対しては、単糖などと同様コスモシール Sugar-D を用いることにより分析可能となります。

ガムなどに含まれる糖アルコール類

AP-0325.png

Conditions
Column COSMOSIL Sugar-D
4.6 mm I.D. × 250 mm
Mobile phase Acetonitrile / H2O = 75 / 25
Flow rate 1.0 mL/min
Tempera ture 30℃
Detection RI
Sample
  1. Xylitol (10 µg)
  2. D-(-)-Mannitol (10 µg)
  3. Maltitol (10 µg)
  4. Palatinit (10 µg)
  5. Maltotriitol (10 µg)
  6. Maltotertaitol (10 µg)

N-アセチル-D-グルコサミン

K-00011.png

Conditions
Column COSMOSIL Sugar-D
4.6 mm I.D. × 250 mm
Mobile phase Acetonitrile / H2O = 80 / 20
Flow rate 1.0 mL/min
Tempera ture 30℃
Detection ELSD
Sample

N-Acetyl-D-glucosamine (1.0 mg/mL)
Inj. Vol. 3.0 µL

3. オリゴ糖の分析

オリゴ糖は、例えば腸内善玉菌を増やす効果など、さまざまな生理活性作用が期待されて健康食品に利用されています。10 糖程度のオリゴ糖の分析は、糖分離用カラムであるコスモシール Sugar-D を用いることにより分析可能となります。

シクロデキストリン

AP-0336.png

Conditions
Column COSMOSIL Sugar-D
4.6 mm I.D. × 250 mm
Mobile phase Acetonitrile / H2O = 65 / 35
Flow rate 1.0 mL/min
Tempera ture 30℃
Detection RI
Sample
  1. α-Cyclodextrin (10 µg)
  2. β-Cyclodextrin (10 µg)
  3. γ-Cyclodextrin (10 µg)

フラクトオリゴ糖

AP-0320.png

Conditions
Column COSMOSIL Sugar-D
4.6 mm I.D. × 250 mm
Mobile phase Acetonitrile / H2O = 70 / 30
Flow rate 1.0 mL/min
Tempera ture 30℃
Detection RI
Sample

Fructooligosaccharides (50 µg)

  1. 1-Kestose
  2. Nystose
  3. 1-Fructofuranosyl-D-nystose

イソマルトオリゴ糖

AP-0322.png

Conditions
Column COSMOSIL Sugar-D
4.6 mm I.D. × 250 mm
Mobile phase Acetonitrile / H2O = 75 / 25
Flow rate 1.0 mL/min
Tempera ture 30℃
Detection RI
Sample

Isomaltooligosaccharides (50 µg)
(Isomaltose,Isomaltotriose, Panose etc.)

ラクチュロース

K-00063.png

Conditions
Column COSMOSIL Sugar-D
4.6 mm I.D. × 250 mm
Mobile phase Acetonitrile / H2O = 80 / 20
Flow rate 1.0 mL/min
Tempera ture 30℃
Detection ELSD
Sample

Lactulose (1.0 mg/mL)
Inj. Vol. 5.0 µL

マルトオリゴ糖

AP-0331.png

Conditions
Column COSMOSIL Sugar-D
4.6 mm I.D. × 250 mm
Mobile phase Acetonitrile / H2O = 65 / 35
Flow rate 1.0 mL/min
Tempera ture 30℃
Detection RI
Sample
  1. D-(+)-Glucose (10 µg)
  2. Maltose (10 µg)
  3. Maltotriose (10 µg)
  4. Maltotetraose (10 µg)
  5. Maltopentaose (10 µg)
  6. Maltohexaose (10 µg)
  7. Maltoheptaose (10 µg)

サポニン

AP-0451.png

Conditions
Column COSMOSIL Sugar-D
4.6 mm I.D. × 150 mm
Mobile phase Acetonitrile / H2O = 75 / 25
Flow rate 1.0 mL/min
Tempera ture 30℃
Detection UV 210 nm
Sample
データー提供 北陸大学 薬学部　川田 幸雄 先生

D-トレハロース

K00045.png

Conditions
Column COSMOSIL Sugar-D
4.6 mm I.D. × 250 mm
Mobile phase Acetonitrile / H2O = 80 / 20
Flow rate 1.0 mL/min
Tempera ture 30℃
Detection RI
Sample

D-(+)-Trehalose (1.0 mg/mL)
Inj. Vol. 5.0 µL

キシロオリゴ糖

AP-0321.png

Conditions
Column COSMOSIL Sugar-D
4.6 mm I.D. × 250 mm
Mobile phase Acetonitrile / H2O = 75 / 25
Flow rate 1.0 mL/min
Tempera ture 30℃
Detection RI
Sample

Xylooligosaccharides (50 µg)
(Xylobiose, Xylotriose etc.)

4. 多糖の分析

最近ヒアルロン酸やコンドロイチンなど食品以外に繊維、化粧品、医薬品な広い範囲に利用され注目されている製品群です。
コンドロイチン硫酸などの多糖の分析には、水系ゲルろ過 HPLC カラムであるコスモシール DIOL-Ⅱシリーズを用いることにより分析が可能となります。また 100 万程度とさらに大きい分子量を有するヒアルロン酸は、カーボンナノチューブ専用Columnであるコスモシール CNT を用いることにより分析が可能となります。

コンドロイチン硫酸 A

H-00022.png

Conditions
Column COSMOSIL 5Diol-300-II
7.5 mm I.D. × 300 mm
Mobile phase 20 mmol/L Phosphate Buffer, 100 mmol/L Na2SO4(pH 6.7)
Flow rate 1.0 mL/min
Tempera ture 30℃
Detection RI
Sample

Chondroitin Sulfate A (20.0 mg/mL)

Inj. Vol. 1.0 µL

コンドロイチン硫酸 C

H-00023.png

Conditions
Column COSMOSIL 5Diol-300-II
7.5 mm I.D. × 300 mm
Mobile phase 20 mmol/L Phosphate Buffer, 100 mmol/L Na2SO4(pH 6.7)
Flow rate 1.0 mL/min
Tempera ture 30℃
Detection RI
Sample

Chondroitin Sulfate C (20.0 mg/mL)

Inj. Vol. 1.0 µL

ヒアルロン酸ナトリウム

AP-1476.png

Conditions
Column COSMOSIL 5Diol-1000-II
7.5 mm I.D. × 300 mm
Mobile phase 20 mmol/L Phosphate Buffer(pH 7.0), 100 mmol/L Na2SO4
Flow rate 1.0 mL/min
Tempera ture 30℃
Detection RI
Sample Hyaluronic Acid Sodium Salt from Microorganism

5. 多糖の分解物の分析

（1）コンドロイチン

多糖は、4. に示したようにゲルろ過カラムで分析可能となりますが、酵素法やヒドラジン分解などで生成した分解物を分析する方法がよく用いられます。

cosmo-fa-1-5-1.png

コンドロイチン硫酸 A の酵素消化物

AP-1082.png

Conditions
Column COSMOSIL Cholester
4.6 mm I.D. × 150 mm
Mobile phase A: 1 mmol/L Tetrabutylammoniumbisulfate / H2O
B: 1 mmol/L Tetrabutylammonium bisulfate-Acetonitrile / H2O = 67 / 33
B conc. 20% → 65%(7 min)→ 65%(12 min)
Flow rate 1.0 mL/min
Tempera ture 40℃
Detection UV 240 nm
Sample

ChondroitinSulfate A
ChodrotinaseAC-II digested

コンドロイチン硫酸 C の酵素消化物

AP-1083.png

Conditions
Column COSMOSIL Cholester
4.6 mm I.D. × 150 mm
Mobile phase A: 1 mmol/L Tetrabutylammoniumbisulfate / H2O
B: 1 mmol/L Tetrabutylammonium bisulfate-Acetonitrile / H2O = 67 / 33
B conc. 20% → 65%(7 min)→ 65%(12 min)
Flow rate 1.0 mL/min
Tempera ture 40℃
Detection UV 240 nm
Sample

ChondroitinSulfate C
ChodrotinaseAC-II digested
（2）糖鎖の誘導体化

一般的に糖鎖は、UV 吸収が小さいため高感度検出が困難となります。そのような場合 PA 化や蛍光誘導体化することにより高感度検出が可能となります。

PA-グルコースオリゴマー

AP-0379.png

Conditions
Column COSMOSIL 5C18-PAQ
4.6 mm I.D. × 150 mm		 Flow rate

1.0 mL/min
Tempera ture 30℃
Mobile phase A: 20 mmol/L Acetate Buffer(pH 3.3)
B: 20 mmol/L Acetate Buffer(pH 3.3)+0.5% Butanol
B(0 → 100%) 45 min Linear gradient		 Detection FLS at Ex. 320 nm
Em. 400 nm
Sample PA-Glucose Oligomer(DP=3-22)

6. 配糖体の分析

（1）分子量 2,000 未満

配糖体には、サポニン・強心配糖体など生理活性をもつものも多く存在します。これらの化合物は、疎水性が高いため C18 など逆相カラムにおいて分析可能となります。

イソフラボン配糖体

AP-0275.png

Conditions
Column COSMOSIL 5C18-MS-II
4.6 mm I.D. × 150 mm
Mobile phase A: Acetonitrile / 20 mmol/L Phosphate Buffer(pH 2.5) = 10 / 90
B: Acetonitrile/ 20 mmol/L Phosphate Buffer(pH 2.5) = 50 / 50
B conc. 0 → 100% 20 min Linear gradient
Flow rate 1.0 mL/min
Tempera ture 30℃
Detection UV 260 nm
Sample
  1. Daidzin (0.05 µg)
  2. Glycitin (0.05 µg)
  3. Genistein (0.05 µg)
  4. Daidzein (0.05 µg)
  5. Glycitein (0.075 µg)
  6. Genistein (0.025 µg)

D-アミグダリン

AP-0944.png

Conditions
Column COSMOSIL 5C18-MS-II
4.6 mm I.D. × 150 mm
Mobile phase Methanol / 50 mmol/L NaH2PO4 = 1 / 5
Flow rate 0.8 mL/min
Tempera ture 45℃
Detection UV 210 nm
Sample

D-(-)-Amygdalin (2.0 µg)

ジンセノシド類

AP-0923.png

Conditions
Column COSMOSIL 5C18-MS-II
4.6 mm I.D. × 150 mm
Mobile phase Acetonitrile / H2O = 30 / 70
Flow rate 1.0 mL/min
Tempera ture 40℃
Detection UV 203 nm
Sample
  1. Ginsenoside Rb1 (2.5 µg)
  2. Ginsenoside Rc (2.5 µg)

ジンセノシド類

AP-0920.png

Conditions
Column COSMOSIL 5C18-MS-II
4.6 mm I.D. × 150 mm
Mobile phase Acetonitrile / H2O = 20 / 80
Flow rate 1.0 mL/min
Tempera ture 30℃
Detection UV 203 nm
Sample
  1. Ginsenoside Rg1 (2.5 µg)
  2. Ginsenoside Rc (2.5 µg)

強心配糖体

AO-0083.png

Conditions
Column COSMOSIL 5C18-AR-II
4.6 mm I.D. × 150 mm
Mobile phase Methanol / H2O = 70 / 30
Flow rate 1.0 mL/min
Tempera ture 30℃
Detection UV 230 nm, 0.32 AUFS
Sample
  1. Digitoxigenin (2.5 µg)
  2. Digitoxin (5.0 µg)

汎用の C18 カラムで分離が不十分な場合、異なる分離特性を有するコスモシール Cholester を用いることにより分析が可能となります。

サポニン類

AP-1021.png

　
Conditions
Columnサイズ 4.6 mm I.D. × 150 mm Sample
  1. Saikosaponin c (1.5 µg)
  2. Saikosaponin a (1.5 µg)
  3. Saikosaponin b2 (1.5 µg)
  4. Saikosaponin b1 (1.5 µg)
  5. Saikosaponin d (1.5 µg)
Mobile phase Acetonitrile / H2O = 45 / 55
Flow rate 1.0 mL/min
Tempera ture 30℃
Detection ELSD, Gain=6

カテキン類

AP-1072.png

Conditions
Column size 4.6 mm I.D. × 150 mm Sample
  1. (-)‐Gallocatechin [(-)‐GC] (0.80 mg/mL)
  2. Caffeine (0.08 mg/mL)
  3. (-)‐Epigallocatechin [(-)‐EGC] (0.80 mg/mL)
  4. (-)‐Catechin [(-)‐C] (0.40 mg/mL)
  5. (-)‐Epicatechin [(-)‐EC] (0.40 mg/mL)
  6. (-)‐Epigallocatechin Gallate [(-)‐EGCg] (0.20 mg/mL)
  7. (-)‐Gallocatechin Gallate [(-)‐GCg] (0.40 mg/mL)
  8. (-)‐Epicatechin Gallate [(-)‐ECg] (0.20 mg/mL)
  9. (-)‐Catechin Gallate [(-)‐Cg] (0.20 mg/mL)
Mobile phase A: Acetonitrile / 20 mmol/L Phosphate Buffer(pH 2.5) = 10 / 90
B: Acetonitrile / 20 mmol/L Phosphate Buffer(pH 2.5) = 30 / 70
B conc. 0 → 100% 20 min Linear gradient
Flow rate 1.0 mL/min
Tempera ture 30℃
Detection UV 280 nm Inj. Vol. 1.0 µL
（2）分子量 2,000 以上

分子量が大きい糖タンパクなどは、タンパク質分離用カラムを用いると分析可能となります。ここではアビジンをタンパク質分離用逆相カラムであるコスモシール Protein-R で分析した例を示しています。

アビジン

R-00078-kakou.png

Conditions
Column COSMOSIL Protein-R
4.6 mm I.D. × 150 mm
Mobile phase A: 0.05% TFA-H2O
B: 0.05% TFA-60% Acetonitrile
B conc. 0 → 100% 20 min Linear gradient
Flow rate 1.0 mL/min
Tempera ture 30℃
Detection UV 220 nm
Sample Avidin (2.0 mg/mL)
Inj. Vol. 2.5 µL
※掲載内容は予告なく変更になる場合があります。