COSMOSIL

COSMOSIL PBr　C18（ODS）カラムでは分離困難な親水性化合物（ニコチンアミド代謝）の一斉分離

全ての生物種に含まれている補酵素のニコチンアミド類をコスモシール PBr カラムで分離することができましたので、紹介します。
なお、本記事は以下論文の解説記事です。

はじめに

ニコチンアミド類について

ニコチンアミド類は補酵素の一種であり、糖尿病・認知症・がんなどの老化関連疾患への関与が報告されているサーチュイン遺伝子の活性化に関係しています（図 1）。サーチュイン遺伝子を活性化させることで、ミトコンドリアのエネルギー生産やテロメアの保護作用が向上すると考えられています。その中でも、ニコチンアミドモノヌクレオチド（NMN）はがんの抑制や老化防止に効果があるとされており、健康食品やサプリメントなどが販売されています。そのため、NMN を含めたニコチンアミド類をバイオマーカーとした分析技術の確立が求められています。


(下記画像をクリックすると拡大します)

COSMOSIL-TN25_zu1.png

図 1. ニコチンアミド類の合成経路


1. NAMN
(Nicotinic Acid Mononucleotide)

2. NMN
(Nicotinamide Mononucleotide)

3. ATP
(Adenosine Triphosphate)

4. IMP
(Inosinic Acid)

5. NR
(Nicotinamide Riboside)

6. Cytidine
COSMOSIL-TN25_zu1_1NAMN.png COSMOSIL-TN25_zu1_2NMN.png COSMOSIL-TN25_zu1_3ATP.png COSMOSIL-TN25_zu1_4IMP.png COSMOSIL-TN25_zu1_5NR.png COSMOSIL-TN25_zu1_6Cytidine.png

7. NA
(Nicotinic Acid)

8. NAD+
(Nicotinamide Adenine Dinucleotide)

9. Inosine

10. NADH
(Nicotinamide Adenine Dinucleotide)

11. NAM
(Nicotinamide)
COSMOSIL-TN25_zu1_7NA.png COSMOSIL-TN25_zu1_8NAD.png COSMOSIL-TN25_zu1_9Inosine.png COSMOSIL-TN25_zu1_10NADH.png COSMOSIL-TN25_zu1_11NAM.png

しかしながら、ニコチンアミド類は親水性が高く、疎水性相互作用を利用して分離する C18 カラムでは保持が小さいため、各化合物を分離することができません。弊社が開発したペンタブロモベンジル基を修飾した PBr カラムは強い分散力を有しており、逆相クロマトグラフィーで親水性化合物の分離が可能です。そこで、PBr カラムを用いて、ニコチンアミド類の合成に関与する 11 種類の化合物の一斉分離を試みました。

C18 カラムと PBr カラムを用いたニコチンアミド類の分析

COSMOSIL-TN25_p1_c18vsPBr.png

Condition
Column COSMOSIL 3C18-AR-Ⅱ, 3.0 mm I.D. × 150 mm
COSMOSIL 3PBr, 3.0 mm I.D. × 150 mm		 Sample
    1. NAMN（Nicotinic Acid Mononucleotide）M.W. 335.20
    2. NMN（Nicotinamide Mononucleotide）M.W. 334.22
    3. ATP（Adenosine Triphosphate）M.W. 507.5
    4. IMP（Inosinic Acid）M.W. 348.21
    5. NR（Nicotinamide Riboside）M.W. 255.5
    6. Cytidine M.W. 243.21
    7. NA（Nicotinic Acid）M.W. 123.11
    8. NAD+ （Nicotinamide Adenine Dinucleotide）M.W. 663.43
    9. Inosine M.W. 268.23
    10. NADH（Nicotinamide Adenine Dinucleotide）M.W. 664.43
    11. NAM（Nicotinamide）M.W. 122.12

＊. 成分不明
Mobile phase

A； Methanol / 20 mmol/L Phosphate Buffer(pH 7.0) = 5 / 95
B； Methanol / 20 mmol/L Phosphate Buffer(pH 7.0) = 20 / 80
B conc. 0% (0 → 5 min), 0 → 100% (5 → 20 min)
Flow rate 0.4 mL/min

Tempera
ture		 40℃
Detection UV 260 nm Inj. Vol. 1 µL

コスモシール PBr カラムを用いることで、C18 カラムでは分離することが難しいニコチンアミドの合成に関与する 11 種類の化合物を簡単なグラジエント条件で分離することができました。

PBr カラムを用いた LC-MS によるニコチンアミド類の分析

食品や生体サンプルの分析の際には、目的物と不純物とのピークが重なることが懸念されるため、LC-MS や LC-MS/MS などを用いて、目的物と不純物の識別を行います。LC-MS の分析においては、各化合物を揮発させて検出するため、移動相に不揮発性の塩が含有した緩衝液などを使用することができません。そこで、LC-MS の分析に使用することができる移動相を使用して、UV 検出下においても良好に各化合物を分離することが可能かを確認しました。


移動相: 緩衝液をりん酸系からぎ酸系に変更

COSMOSIL-TN25_p2-idousou_AF.png

※ 移動相にりん酸緩衝液を使用した場合（上記「 C18 カラムと PBr カラムを用いたニコチンアミド類の分析」参照）と比較すると、りん酸緩衝液での溶出順は、4. IMP → 3. ATP → 7. NA → 5. NR ですが、ぎ酸緩衝液では 3. ATP → 7. NA → 4. IMP → 5. NR となり溶出順が異なっています。

Condition
Column COSMOSIL 3PBr, 3.0 mm I.D. × 150 mm Sample
    1. NAMN（Nicotinic Acid Mononucleotide）M.W. 335.20
    2. NMN（Nicotinamide Mononucleotide）M.W. 334.22
    3. ATP（Adenosine Triphosphate）M.W. 507.5
    4. IMP（Inosinic Acid）M.W. 348.21
    5.  NR（Nicotinamide Riboside）M.W. 255.5
    6. Cytidine M.W. 243.21
    7. NA（Nicotinic Acid）M.W. 123.11
    8. NAD+ （Nicotinamide Adenine Dinucleotide）M.W. 663.43
    9. Inosine M.W. 268.23
    10. NADH（Nicotinamide Adenine Dinucleotide）M.W. 664.43
    11. NAM（Nicotinamide）M.W. 122.12

＊. 成分不明
Mobile phase

A； Methanol / 20 mmol/L Ammonium Formate = 5 / 95
B； Methanol / 20 mmol/L Ammonium Formate = 20 / 80
B conc. 0% (0 → 5 min), 0 → 100% (5 → 20 min)
Flow rate 0.4 mL/min

Tempera
ture		 40℃
Detection UV 260 nm Inj. Vol. 1 µL

移動相の変更により、溶出順に変化は見られましたが、ニコチンアミドの合成に関与する 11 種類の化合物を分離することができました。



つづいて、LC-MSを使用し、上記と同様の条件で各化合物を良好に検出することが可能かを確認しました。

COSMOSIL-TN25_p2-LC-MS.png

Condition
Column COSMOSIL 3PBr, 3.0 mm I.D. × 150 mm Sample
    1. NAMN（Nicotinic Acid Mononucleotide）M.W. 335.20
    2. NMN（Nicotinamide Mononucleotide）M.W. 334.22
    3. ATP（Adenosine Triphosphate）M.W. 507.5
    4. IMP（Inosinic Acid）M.W. 348.21
    5.  NR（Nicotinamide Riboside）M.W. 255.5
    6. Cytidine M.W. 243.21
    7. NA（Nicotinic Acid）M.W. 123.11
    8. NAD+ （Nicotinamide Adenine Dinucleotide）M.W. 663.43
    9. Inosine M.W. 268.23
    10. NADH（Nicotinamide Adenine Dinucleotide）M.W. 664.43
    11. NAM（Nicotinamide）M.W. 122.12
Mobile phase

A； Methanol / 20 mmol/L Ammonium Formate = 5 / 95
B； Methanol / 20 mmol/L Ammonium Formate = 20 / 80
B conc. 0% (0 → 5 min), 0 → 100% (5→20 min)
Flow rate 0.4 mL/min

Tempera
ture		 40℃
Detection MS Inj. Vol. 1 µL

PBr カラムを用いることで、分子量の差が 1 である NAMN と NMN に加えて、計 11 種類のニコチンアミド類をりん酸系（上記 「C18 カラムと PBr カラムを用いたニコチンアミド類の分析」参照）、ぎ酸系の 2 種類の移動相で分離することができました。

PBr カラムを用いたニコチンアミド代謝物の検出限界

濃度の異なるニコチンアミド類を UV 検出器で分析した際のピーク形状と検量線

COSMOSIL-TN25_p3_ue-peak.png COSMOSIL-TN25_p3_ue-kenryousen.png

Condition
Column COSMOSIL 3PBr, 3.0 mm I.D. × 150 mm Sample
  1. NMN（Nicotinamide Mononucleotide）M.W. 334.22
  2. NAM（Nicotinamide）M.W. 122.12
  3. NAD+ （Nicotinamide Adenine Dinucleotide）M.W. 663.43
Mobile phase

A； Methanol / 20 mmol/L Ammonium Formate = 5 / 95
B； Methanol / 20 mmol/L Ammonium Formate = 20 / 80
B conc. 0% (0 → 5 min), 0 → 90% (5 → 20 min)
Flow rate 0.4 mL/min

Tempera
ture		 40℃
Detection UV 260 nm Inj. Vol. 1 µL

濃度の異なる 3 種類のニコチンアミド類を分析したところ、直線的な検量線を作成することができ、NAM は 50 µM、NMN は 25 µM、NAD+ は 10 µM まで検出することが可能でした（注入量を増加させれば、数 µM 以下の濃度においても分析可能です）。また、濃度を低下させても、それぞれの化合物由来のピーク形状も良好でした。

サンプルの前処理

食品や生体サンプル中には多量のタンパク質や脂質などの成分が含まれています。タンパク質や脂質はカラムに吸着しやすいため、代謝物質などを HPLC で分析する際には、前処理によりこれらの物質を除去する必要があります。


前処理操作　
※抽出・破砕処理を行い、取得した HPLC サンプルはムラがない均一な状態でサンプリングする必要があります。

(下記画像をクリックすると拡大します) COSMOSIL-TN25_p3_maesyori.png



トマトの前処理手順を動画でご覧になるにはこちら



参考文献: 馬場 健史 他. メタボロミクス実践ガイド. 第 1 版, 羊土社, 2021.

食品や生体サンプル中の NMN の分析

NMN の含有量が多いことが報告されているトマトおよび HEK 293 を例として細胞中のニコチンアミド類を PBr カラムを用いて分析しました。 COSMOSIL-TN25_p4_NMN.png

Condition
Column COSMOSIL 3PBr, 3.0 mm I.D. × 150 mm Sample
  • NMN（Nicotinamide Mononucleotide）M.W. 334.22
  • ATP（Adenosine Triphosphate）M.W. 507.5
  • NR（Nicotinamide Riboside）M.W. 255.5
  • Cytidine M.W. 243.21
  • NAD+ （Nicotinamide Adenine Dinucleotide）M.W. 663.43
Mobile phase

A； Methanol / 20 mmol/L Ammonium Formate = 5 / 95
B； Methanol / 20 mmol/L Ammonium Formate = 20 / 80
B conc. 0% (0 → 5 min), 0 → 90% (5 → 20 min)
Flow rate 0.4 mL/min

Tempera
ture		 40℃
Detection MS Inj. Vol. 1 µL

LC-MS で分析した結果、トマトおよび HEK 293 細胞中に含有している NMN やその他代謝物を検出することができました。

分析に用いた製品

分類用途製品名毒劇物メーカー / 規格製品番号容量価格
カラム 分析 コスモシール 3PBr パックドカラム 3.0 mm I.D. × 150 mm －

SP

（高速液体クロマトグラフ用）

 19352-91 1 pkg e-Nacalai.jpg

コスモシール 3C18-AR-II パックドカラム 3.0 mm I.D. × 150 mm

 ご照会 1 pkg ご照会
試薬 移動相 メタノール 劇

SP

（高速液体クロマトグラフ用）

 21929-81 1 L e-Nacalai.jpg
蒸留水 － 14029-91 1 L e-Nacalai.jpg
りん酸緩衝液(pH 7.0)(5倍濃縮) － 08968-81 1 L e-Nacalai.jpg
ぎ酸アンモニウム － GR 02509-55 500 g e-Nacalai.jpg
クロロホルム 劇 JIS 試薬特級 08402-55 500 mL e-Nacalai.jpg
器具 サンプル前処理 Millex-LG　0.20 µm, 13 mm － MERCK SLLG013SL 100 pkg e-Nacalai.jpg
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