COSMOSIL

② よくあるご質問

Q1. カラムの使用可能圧力の上限は?

1. カラムの使用可能圧力の上限は?
カラム圧力の上限

超高速 LC 用カラム
(フルポーラスシリカゲル)

COSMOSIL 2.5C18-MS-II
COSMOSIL 2.5Cholester
COSMOSIL 2.5πNAP

30 MPa

超高速 LC 用カラム
(Core-Shellシリカゲル)

COSMOCORE 2.6C18
COSMOCORE 2.6Cholester
COSMOCORE 2.6PBr

60 MPa
3C18 (粒子径 3 µm)

COSMOSIL 3C18-MS-II
COSMOSIL 3C18-AR-II
COSMOSIL 3C18-EB

30 MPa
SFC 用カラム 内径 2.1, 4.6, 10 mm 30 MPa
内径 20 mm 23 MPa
光学異性体分離用カラム COSMOSIL CHiRAL シリーズ 30 MPa
CNT 用カラム COSMOSIL CNT シリーズ 15 MPa

上記以外の
COSMOSIL カラム

分析用カラム(内径 1.0~7.5 mm) 20 MPa
分取用カラム(内径 10 mm 以上) 15 MPa

【注意事項】
使用可能範囲内であっても大きな圧力変動はカラムへの負担になり、劣化につながる恐れがありますのでできるだけ避けてください。

Q2. 移動相の流速の上限は?

2. 移動相の流速の上限は?
Q1 に記載の使用可能圧力以下であれば、流速をあげることが可能です。

【注意事項】
できるだけ「⑩カラム内径について(スケールアップ・スケールダウン)」に示した標準流速でのご使用をお薦めします。一般的にカラム圧が高くなるほどカラムの寿命は短くなります。

Q3. カラムの使用可能 pH は?

3. カラムの使用可能 pH は?
カラム使用可能な pH

COSMOSIL シリーズ
(フルポーラスシリカゲルベース)

COSMOSIL C18-MS-II
COSMOSIL C18-EB

pH 2 ~ 10

COSMOSIL C18-AR-II

pH 1.5 ~ 7.5

上記以外のカラム

pH 2 ~ 7.5

COSMOCORE シリーズ
(Core-Shell シリカゲルベース)

COSMOCORE シリーズ

pH 2 ~ 7.5

COSMOGELシリーズ
(ポリマーベース)

COSMOGEL IEX シリーズ

pH 2 ~ 12
【注意事項】
ゲルの使用可能領域となります。分析される場合は、サンプルが解離する pH 域にてご使用ください。

Q4. 緩衝液や塩の濃度は?

4. 緩衝液や塩の濃度は?
カラム緩衝液、塩の濃度

逆相、順相、HILIC

緩衝液濃度範囲:0.005 ~ 0.1 mol/L
添加剤濃度(トリフルオロ酢酸、ぎ酸、酢酸など): 0.1 ~ 1.0%

イオン交換

COSMOGEL IEX シリーズ

緩衝液濃度範囲:0.02 ~ 0.05 mol/L
水溶性有機溶媒濃度(メタノールなど)上限:20%以下

ゲルろ過

COSMOSIL Diol シリーズ

緩衝液濃度上限:0.5 mol/L 以下 
塩濃度上限:0.5 mol/L 以下

疎水クロマト

COSMOSIL HIC

緩衝液濃度上限:0.5 mol/L 以下
塩濃度上限:2 mol/L 以下

SFC

酸性化合物:0.1%トリフルオロ酢酸、0.1%酢酸、0.1%ぎ酸
【注意事項】
  1. 不溶物はカラムの劣化につながります。緩衝液や塩の溶液は必ずろ過してから使用してください。
  2. 分析中に塩が析出するとカラムや装置の故障の原因になりますので塩が析出しない濃度でご使用ください。
  3. 有機溶媒と混合後に析出する場合が多いので、HPLC 装置内で移動相を混合する場合には特にご注意ください。
  4. 装置やカラム内に有機溶媒を多く含む場合、まず塩を含まない移動相で置換した後、塩を含む移動相を送液してください。

Q5. 移動相の調製方法は?

5. 移動相の調製方法は?
「④ 移動相の調製方法」をご参照ください。

【注意事項】
  1. 有機溶媒比率、緩衝液の濃度や pH は分析結果に影響を与えるため正確に調製してください。
  2. 有機溶媒と水溶液を混合後は必ず脱気してください。

Q6. 移動相に用いる溶媒のグレードは?

6. 移動相に用いる溶媒のグレードは?
高速液体クロマトグラフィー(HPLC)用溶媒を使用することをお薦めします。

【注意事項】
  1. 特級グレードは紫外吸収を持つ不純物の量が多いためグラジエント分析や微量分析には適していません。特に 210 ~ 220 nm など短波長で検出する場合、ベースラインの安定性や検出感度に大きな差が生じ適正な分析ができない恐れがあります。
  2. 酸化防止剤含有の特級グレード溶媒(テトラヒドロフラン、クロロホルムなど)を使用すると含有の酸化防止剤がゴーストピークの原因となります。
  3. トリフルオロ酢酸など変質しやすい添加剤は、特級グレードを使用するとベースラインの乱れの原因となる恐れがあります。

Q7. アセトニトリルとメタノールの違いは?

7. アセトニトリルとメタノールの違いは?
逆相クロマトグラフィーでは、有機溶媒としてアセトニトリルとメタノールがよく用いられます。
その違いを表にまとめましたので、ご参照ください。

アセトニトリル(HPLC 用)メタノール(HPLC 用)

圧力

P235-atu.jpg

カラム :5C18-MS-Ⅱ 4.6 mmI.D.×150 mm
流速  :1.0 mL/min
温度  :30 ℃

カラムにかかる圧力は、有機溶媒の種類や混合比によって異なります。
同じ濃度の場合、アセトニトリルのほうがメタノールより圧力は低くなります。

溶出力

P235-yousyutu.jpg

カラム :5C18-MS-Ⅱ
              4.6 mmI.D.×150 mm
流速  :1.0 mL/min
温度  :30 ℃

同じ濃度比の(アセトニトリル / 水)と(メタノール / 水)では溶出力は(アセトニトリル / 水)の方が強くなります。有機溶媒濃度約 30% 〜 80%の範囲では(アセトニトリル / 水)の有機溶媒濃度を約 10%上げた(メタノール / 水)でほぼ同等の溶出力となります。
(例アセトニトリル / 水=60 / 40 →メタノール / 水=70 / 30)

吸光度

・低波長(250 nm 以下)での UV 吸収が小さい
・低波長の分析に◎

・低波長(250 nm 以下)での UV 吸収が大きい
・低波長の分析には×

移動相の脱気

・水と混ざると吸熱する
・気泡が抜けにくく脱気しにくい

・水と混ざると発熱する
・気泡が抜けやすく脱気しやすい

Q8. LC/MS や ELSD 検出器で使用できる移動相は?

8. LC/MS や ELSD 検出器で使用できる移動相は?
液体クロマトグラフ質量分析計(LC/MS)や蒸発光散乱検出器(ELSD)では揮発性の移動相を使う必要があります。 HPLC で汎用されるりん酸緩衝液は使用できません。
分類使用可能な溶媒・添加剤

溶媒

メタノール、エタノール、アセトニトリル、水など

pH 調整試薬

酢酸、ぎ酸、トリフルオロ酢酸、アンモニア水、酢酸アンモニウム、ぎ酸アンモニウムなど

イオンペア試薬

ジブチルアミン、トリエチルアミンなど

【注意事項】

その他、DMSO(ジメチルスルホキシド)、DMF(ジメチルホルムアミド)など揮発しにくい溶媒は少量であればメタノールやアセトニトリルと混合して使用することは可能です。ただし含有量が増えると揮発性が減少し感度が低下する恐れがあります。

Q9. イオンペア試薬を使用するときの注意点は?

9. イオンペア試薬を使用するときの注意点は?
・イオンペア試薬の濃度は通常 5 ~ 10 mmol/L 程度で行ってください。
・酸性イオンペア試薬の場合は pH 7 の移動相、塩基性イオンペア試薬の場合は pH 2.5 の移動相で行います。
・平衡時間を十分とってください。
【注意事項】
  1. イオンペア濃度が濃くなるほど保持時間は長くなります。
  2. 移動相の pH はサンプルが充分にイオン化する pH に設定してください。
  3. イオンペア試薬を含まない移動相に比べて長い平衡時間が必要です。
  4. イオンペア試薬を用いると完全にイオンペア試薬を除去することは難しいため、イオンペア試薬使用専用カラムにすることをお薦めします。

Q10. 移動相の送液方向は?

10. 移動相の送液方向は?
カラムラベルに記載されている方向に送液してください。
【注意事項】
逆方向に送液するとカラム内部の充填剤の充填状態が乱れ、理論段数の低下の原因となります。
また、カラムの入り口側の先端部分に不純物が吸着していることがあるため、検出器や配管を汚し、ノイズの原因にもなります。

Q11. カラムの使用可能温度は?

11. カラムの使用可能温度は?
60℃程度まで分析可能ですが、通常は 20 ~ 50℃の一定温度で分析を行ってください。 SFC 用カラムは、50℃以下でご使用ください。
【注意事項】
  1. アルカリ性・酸性条件下での高温分析は、特に劣化を早める恐れがあります。
  2. カラムの温度によって保持時間は変動するので分析中は一定の温度を保ってください。なお一般的に温度が高いほどカラム圧力は低く、保持時間は短くなります。

Q12. カラム出荷時の封入溶媒は?

12. カラム出荷時の封入溶媒は?

充填剤の種類により異なります。カラムの検査成績書の下部に記載してあります。 Q2-kensaseisekisyo.png



















Q13. カラムの洗浄方法は?

13. カラムの洗浄方法は?
①カラム内の緩衝液、塩、酸を除去する方法
 ご使用の移動相から緩衝液、塩、酸を抜いた溶媒で 10 ~ 15 分洗浄後、保管してください。
(例: メタノール / 20 mmol/L りん酸緩衝液 = 50 / 50 を使用していた場合は、メタノール / 水 = 50 / 50 で洗浄してください)
【注意事項】
有機溶媒と水の比率を変えると、緩衝液の成分が析出する場合があります。

②カラム内の吸着物を洗浄する方法、ベースラインが安定しない場合の改善方法
サンプルをよく溶かし、また、溶出力の強いものを使用してください。
分類使用可能な溶媒・添加剤

逆相

(1)サンプルがタンパク質でない場合
メタノールやテトラヒドロフランなど
逆相クロマトグラフ用カラム洗浄キット(#08966-30)


(2)サンプルがタンパク質の場合
0.1%程度トリフルオロ酢酸含有の 50 ~ 70%程度のアセトニトリル / 水
(注意)タンパク質の種類により有機溶媒濃度が高くなると析出する場合もあります。

順相

メタノール、テトラヒドロフラン、エタノールなど

フラーレン用カラム

1,2,4-トリクロロベンゼンなど

Sugar-D・NH2・HILIC

アセトニトリル / 水 = 50 / 50
Sugar-D および HILIC は水 100%での洗浄も可能です。

SFC 用カラム

使用された移動相よりも共溶媒の濃度を高めた移動相で洗浄してください。

【注意事項】
シリカゲルを溶解するような pH 7.5 以上のアルカリ性水溶液および、固定相を剥離するような pH 1.5 以下の強酸の溶液は使用できません。

③カラム入口につまった不溶物を除去する方法
 カラムの送液方法とは逆向きに、通常分析時の半分程度の流速で洗浄します。
【注意事項】
カラムのアウト側は検出器から外した状態で行ってください。

④カラム圧力が高い場合には、「⑦ 分析圧上昇時の対処方法」をご参照ください。

Q14. カラムの保管方法は?

14. カラムの保管方法は?
①短期間(数日)の保管
ご使用の移動相から緩衝液、塩、酸を抜いた溶媒で 10 ~ 15 分洗浄後、保管してください。
(例: メタノール / 20 mmol/L りん酸緩衝液 = 50 / 50 を使用していた場合は、メタノール / 水 = 50 / 50 で洗浄してください)コスモゲル IEXは 20~50 mmol/L 緩衝液(pH 4.5 ~ 9.5)で保存してください。

②長期間(1 カ月以上)の場合
カビの発生、カラムの乾燥、充填剤の劣化を防ぐため下記の溶媒に置換してください。
分類推奨の保存溶媒

逆相

逆相クロマトグラフ用カラム保存液(# 08967-20)
メタノール / 水 = 70 / 30、 アセトニトリル / 水 = 70 / 30 など

順相

ハロゲンや酸を含まない有機溶媒 (ヘキサン / エタノール = 90 / 10 など)

イオン交換・ゲルろ過・疎水クロマト

0.05%アジ化ナトリウム水溶液など

フラーレン用カラム

トルエンなど

Sugar-D・NH2・HILIC

アセトニトリル / 水 =70 / 30 など

SFC 用カラム

メタノール、エタノール

【注意事項】
いずれの場合も密栓をしっかり締め、振動のない冷暗所で保管してください。

Q15. カラムの寿命は?

15. カラムの寿命は?
使用条件(サンプルの種類、移動相の有機溶媒濃度・塩の種類・酸の種類・pH など)によってカラムの寿命は変化するため一概には言えません。
【注意事項】
カラム寿命が短い場合、原因がサンプル由来であることがほとんどです。サンプルの前処理についてご検討いただくことをお薦めします。詳細は「⑤ HPLC 用サンプルの前処理」をご参照ください。

Q16. 劣化したカラムに起こる症状は?

16. 劣化したカラムに起こる症状は?
カラム圧力の上昇、理論段数の低下、保持時間の減少、ピーク形状の崩れ、分離度の低下などが起こります。
【注意事項】
対処法については「③トラブルシューティング」をご参照ください。

Q17. カラムの劣化状態の調べ方は?

17. カラムの劣化状態の調べ方は?

カラムに添付されています、「検査成績書」と同条件もしくは同等条件で測定し、カラムの劣化の程度を評価してください。評価される場合は毎回同じ装置で測定し、記録をとっておくと劣化の程度がよく分かります。
各項目についてカラム交換の基準を設け、外れている場合はカラム交換をお薦めします。


評価項目評価内容

保持比(k')

固定相が切断されると保持比が小さくなります。

理論段数(N)

充填剤の汚れや充填状態の変化によって低下します。

ピーク対称性(S)

充填状態の乱れ、汚れの吸着によってピーク対称性が悪くなります。

圧力

カラムのフィルターの目づまり、充填剤へのサンプルの吸着、充填剤の微細化などより高くなります。

【参考】

カラム交換の基準については使用される方の状況によりますので一概には言えませんが、目安として 5C18 -MS-Ⅱ(4.6 mmI.D.-150 mm) での参考値を示します。
・保持比(k'): ナフタレンの k'初期値の 90%以下
・理論段数(N): 9,000 以下
・ピーク対称性(S): 0.86~1.25 の範囲から外れる
・圧力: 20 MPa 以上

Q18. セミミクロカラムを使用するときの注意点は?

18. セミミクロカラムを使用するときの注意点は?
インジェクター、配管、検出器の検出セルをセミミクロ用にしてください。
【注意事項】
移動相の流速をカラムの断面積に比例して設定してください。具体的には、「⑩カラム内径について(スケールアップ・スケールダウン)」をご参照ください。

Q19. 超高速 LC カラムを使用するときの注意点は?

19. 超高速 LC カラムを使用するときの注意点は?
・超高速 LC 対応の装置を使用してください。
・一般の HPLC 装置をご使用の場合には、検出器のレスポンスを短く(例:0.02 sec)してください。
・インジェクター、配管、検出器の検出セルをセミミクロ用にしてください。
・カラム圧力は COSMOSIL 2.5 シリーズ (フルポーラスシリカゲル)30 MPa 以下、COSMOCORE シリーズ(Core-Shell シリカゲル)60 MPa 以下でご使用ください。
・COSMOSIL シリーズ、COSMOCORE シリーズで接続タイプが異なります。

Q20. 分取カラムで精製できる量は?

20. 分取カラムで精製できる量は?
サンプルの分離度や移動相に対する溶解性により大きく異なります。まず分析用カラムで最大負荷量を決定し、カラムの内径の断面積比から最大分取量を決定します。
【注意事項】
カラムの内径、流速、配管などは、「⑩カラム内径について(スケールアップ・スケールダウン)」をご参照ください。

Q21. 同じ装置で逆相と順相の両方を使用するときの注意点は?

21. 同じ装置で逆相と順相の両方を使用するときの注意点は?
エタノールなど、どちらの移動相にも混じりあう溶媒で置換してから使用する移動相に切り換えてください。
【注意事項】
逆相系の移動相(メタノール-水など)と順相系の移動相(ヘキサンなど)は混じりあわないため、直接移動相を交換すると、溶媒置換がうまくできません。

Q22. 装置とカラムとの接続は?

22. 装置とカラムとの接続は?
コスモシール、コスモゲルカラムの接続タイプは Waters 型が標準です。コスモコアカラムの接続タイプは Waters 社 UHPLC カラムと同タイプです。
【注意事項】
汎用 HPLC 装置で Waters 型の接続が可能ですが、初めてご使用になられる場合には、念のためご使用の装置のメーカーに Waters 型の接続が可能かお問合せください。

Q23. 検出器の使い分けは?

23. 検出器の使い分けは?
検出器の選択はサンプルの性質や測定の目的に応じて決めてください。
検出器特長

紫外可視光度検出器
(UV/VIS 検出器)

【検出方法】

サンプルの吸光度を検出

【適用化合物】

UV 吸収がある化合物やラベル化したサンプルに対して高感度での分析が可能
UV 吸収がない化合物には適用不可

【特長】

簡便であり、最も汎用されています。

蛍光検出器
(FLD 検出器)

【検出方法】

光を照射して励起されたサンプルの蛍光を検出

【適用化合物】

蛍光性を持っているサンプル

【特長】

UV 吸収が小さい、あるいはない化合物を蛍光ラベル化したサンプルの分析や検出感度が優れているため微量成分の分析にも使用します。

示差屈折率検出器
(RI 検出器)

【検出方法】

サンプルと移動相の屈折率の差によって検出

【適用化合物】

全サンプルを検出可能

【特長】

UV 吸収が小さい、あるいはない化合物(糖・アルコール類・アミノ酸など)の分析に使用される。
欠点として温度・移動相組成・流量変化に非常に敏感であり取り扱いには注意が必要です。
グラジエント分析には適用不可

電気化学検出器
(ECD 検出器)

【検出方法】

酸化・還元性化合物など電気化学的に活性な化合物を検出

蒸発光散乱検出器
(ELSD 検出器)

【検出方法】

移動相を蒸発させることにより目的化合物を微粒子化し、その散乱光を測定し検出

【適用化合物】

UV 吸収が小さいあるいはない化合物(糖・アルコール類・アミノ酸など)

【特長】

グラジエント分析にも使用可能
欠点として低沸点の化合物には使用できません。

質量分析検出器
(MS 検出器)

【特長】

分離した成分の MS スペクトルを測定することができ、定性分析に有用です。
欠点として使用できる移動相が制限されます。

Q24. 圧力の表示単位は?

24. 圧力の表示単位は?
多くは SI 単位である MPa(メガパスカル)で表示されています。
【注意事項】
海外や古い装置では他の表示も見られます。(換算式:1 MPa=10.197 kgf/cm2=145.0 psi=10 bar)

Q25. デッドボリュームとは?

25. デッドボリュームとは?
デッドボリュームとは、インジェクターから検出器までの流路の体積のうち、分離に関係のない空間のことです。
【注意事項】
  1. デッドボリュームが大きいと、サンプルの拡散が起こりピーク形状の異常を引き起こす恐れがあります。
  2. インジェクターや検出器セル、インジェクターから検出器までの配管はカラム内径にあったものを選択しデッドボリュームをできるだけ減らす必要があります。配管の内径、セルの選択については、「⑩カラム内径について(スケールアップ・スケールダウン)」をご参照ください。

Q26. カラムプレフィルターとガードカラムの違いは?

26. カラムプレフィルターとガードカラムの違いは?
①カラムプレフィルター(下図 4. )

  ポンプとインジェクターとの間に設置し、主に移動相に含まれる不純物を除去するために使用します。


②ガードカラム(下図 6. )

  インジェクターと分析カラムとの間に設置し、主にサンプルに含まれる吸着物を除去するために使用します。


「⑧ガードカラムの選択と効果」をご参照ください。
Q26-HPLC-ryuuro.png

Q27. サンプルの前処理方法は?

27. サンプルの前処理方法は?
「⑤ HPLC 用サンプルの前処理」をご参照ください。

Q28. 内標準物質の選定方法は?

28. 内標準物質の選定方法は?
内標準物質は下記のような条件をみたせばどのような化合物でも使用可能です。
・目的物質とピークが重ならず、かつ近い位置にピークが現れること
・テーリングや吸着を起こさないこと
・入手が容易で安価であること
・化合物として安定であること

日本薬局方では、Methyl p-Hydroxybenzoate ~ Butyl p-Hydroxybenzoate が汎用されています。