製品情報

ヒト iPS / ES 細胞を約 1 週間で分化Elixirgen Scientific 社 分化誘導キット

Elixirgen Scientific 社は米国メリーランド州ボルチモアにある幹細胞技術に特化したバイオテクノロジー企業です。幹細胞関連産業の高コストという課題の要因として、多能性幹細胞から特定細胞への分化誘導にかかる期間とその非効率性にあります。Elixirgen Scientific 社は分化誘導にかかる期間を 1 週間程度まで短縮する技術を商業化し、イノベーションを加速しています。
Elixirgen Scientific 社の分化誘導キットは、センダイウイルスもしくは合成 RNA を多能性幹細胞に導入し、転写因子を発現させるため、ゲノム改変を伴わず短期間で効率よく分化させることが可能です。

イメージ図

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製品ラインアップ

Elixirgen Scientific 社では、さまざまな分化誘導キットを取り揃えています。
以下では、三胚葉分化能評価キットおよび血管内皮細胞分化誘導キットを紹介しています。
その他の製品の詳細は、Elixirgen Scientific 社 Web site (https://elixirgenscientific.com) をご参照ください。

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三胚葉分化能評価キット
Quick-Trilineage™ Differentiation Kit(センダイウイルスキット)

Quick-Trilineage™ Differentiation Kit は、 ヒト iPS 細胞や ES 細胞から三胚葉由来細胞(神経、骨格筋、肝)への分化能を 6 日で評価可能なキットです。多能性幹細胞の品質管理にぜひご利用ください。

特長

  • 6 日で三胚葉由来細胞への分化能の評価が可能

プロトコール

Q3D-protocol.png

使用例

三胚葉への分化能評価

分化した細胞の免染蛍光染色画像(6 日目)

p2-mensengazou_1.png

胚葉特異的マーカーの発現量を解析(6 日目)

p2-bougurafu.png

各胚葉体でそれぞれの分化マーカーが発現していることが示されています。

価格表

製品名 内容 メーカー製品番号 容量
(24 ウェルプレート中)
オンライン
カタログへ
Quick-Trilineage™ Differentiation Kit センダイ
ウイルスキット
EXGS-Q3D 6 ウェル
(1 種 2 ウェル)
e-Nacalai.jpg
カルタヘナ法該当

血管内皮細胞分化誘導キット
Quick-Endothelium™ Vascular(合成 RNA キット)

Quick-Endothelium™ Vascular には、血管内皮細胞への分化誘導に必要な試薬と培養液が含まれています。お手持ちのヒト iPS 細胞もしくは ES 細胞を Quick-Endothelium™ Vascular で処理した後、7 日後にほぼ 100% の効率*で CD31 陽性細胞が現れます。
*薬剤選択を利用する場合

特長

  • わずか 7 日で分化
  • 4 種類の試薬を 2 日にわたって培養液に添加するだけ

プロトコール

QEV-protocol.png

1 キットにつきおよそ 1 X 106 個のヒト iPS 細胞または ES 細胞を使用し、7 日目にはおよそ 0.5 X 106 個の CD31 陽性細胞が得られます。
7 日目以降は、Elixirgen Scientific 社が販売する維持培地で第二世代まで継代培養が可能です。およそ 3 X 107 個の CD31 陽性細胞が得られます。

使用例

分化誘導過程

位相差画像
 0 日目:ヒト iPS 細胞(未分化)  4 日目
p3-bunkayudoukatei-0niti.png p3-bunkayudoukatei-4niti.png

定量的 RT-PCR
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血管内皮細胞マーカーの発現量を比率で示しており、ヒト iPS 細胞と比べ、それを分化させて作製した血管内皮細胞(4 日目)でマーカーの発現量が増加していることがわかる。

免疫蛍光染色
 7 日目  22 日目(継代後)
p3-menekikeikousensyoku-7.png p3-menekikeikousensyoku-22.png
緑:CD31 の免疫染色
青:細胞核を Hoechst 33342 で対比染色

神経細胞と共培養した「ミニ脳」の免疫蛍光染色

ヒト iPS 細胞を Elixirgen Scientific 社が販売している血管内皮細胞の分化誘導キットと神経細胞の分化誘導キットを利用して、共培養することも可能です。下記の免疫蛍光染色画像は底面が U 字型の形をした 96 ウェルマイクロプレート上で作成した iPS 細胞から 21 日目時点のオルガノイドです。

p4-mininou-gazou-tekisutonuki.png
緑:CD31 の免疫染色
赤:TUBB3 の免疫染色
青:細胞核を Hoechst 33342 で対比染色

上記の「ミニ脳」作成用のキット Quick-miniBrain™ - SeV neuron and mRNA EC Kit(#EXGS-QMBSVMR)も販売しています。

価格表

細胞腫製品名内容メーカー製品番号容量
(24 ウェルプレート中)
オンライン
カタログへ
血管
内皮細胞
Quick-Endothelium™ Vascular - mRNA Complete Kit with Optional Drug Selection 合成 RNA キット EXGS-QEV 4 ウェル e-Nacalai.jpg
Quick-Endothelium™ Vascular - Maintenance Medium 維持培地 EXGS-QEVM 4 ウェル分を
2 週間維持
e-Nacalai.jpg

その他キット

価格表

細胞腫製品名毒劇物内容

メーカー

製品番号

容量

(24 ウェルプレート中)

オンライン
カタログへ
神経
ミックス*1
Quick-Neuron™ Mixed - SeV Complete Kit*2 センダイウイルスキット EXGS-QNMSV 4 ウェル e-Nacalai.jpg
Quick-Neuron™ Mixed - Maintenance Medium 維持培地 EXGS-QNMM 4 ウェル分を
2 週間維持
e-Nacalai.jpg
コリン
作動性神経
Quick-Neuron™ Cholinergic - SeV Complete Kit*2 センダイウイルスキット EXGS-QNCSV 4 ウェル e-Nacalai.jpg
Quick-Neuron™ Cholinergic - SeV Complete Kit for 96-well microplate format*2 センダイウイルスキット EXGS-QNCSV96 48 ウェル*3 e-Nacalai.jpg
Quick-Neuron™ Cholinergic - mRNA Complete Kit

合成 RNA
キット

EXGS-QNC 4 ウェル e-Nacalai.jpg
Quick-Neuron™ Cholinergic - Maintenance Medium 維持培地 EXGS-QNCM 4 ウェル分を
2 週間維持
e-Nacalai.jpg
ドーパミン
神経
Quick-Neuron™ Dopaminergic - SeV Complete Kit*2 センダイウイルスキット EXGS-QNDSV 4 ウェル e-Nacalai.jpg
Quick-Neuron™ Dopaminergic - mRNA Complete Kit

合成 RNA
キット

EXGS-QND 4 ウェル e-Nacalai.jpg
Quick-Neuron™ Dopaminergic - Maintenance Medium 維持培地 EXGS-QNDM 4 ウェル分を
2 週間維持
e-Nacalai.jpg
GABA
作動性神経
Quick-Neuron™ GABAergic - SeV Complete Kit*2 センダイウイルスキット EXGS-QNGSV 4 ウェル e-Nacalai.jpg
Quick-Neuron™ GABAergic - mRNA Complete Kit

合成 RNA
キット

EXGS-QNG 4 ウェル e-Nacalai.jpg
Quick-Neuron™ GABAergic - Maintenance Medium 維持培地 EXGS-QNGM 4 ウェル分を
2 週間維持
e-Nacalai.jpg
ミニ脳 Quick-miniBrain™ - SeV neuron and mRNA EC Kit*2 センダイウイルス・

合成 RNA
キット

EXGS-QMBSVMR 40 ウェル*3 e-Nacalai.jpg
Quick-Neuron™ Mixed - Maintenance Medium 維持培地 EXGS-QNMM 4 ウェル分を
2 週間維持
e-Nacalai.jpg
骨格筋細胞 Quick-Muscle™ Skeletal - SeV Complete Kit*2 センダイウイルスキット EXGS-QMSSV 4 ウェル e-Nacalai.jpg
Quick-Muscle™ Skeletal - Maintenance Medium 維持培地 EXGS-QMSM 4 ウェル分を
2 週間維持
e-Nacalai.jpg
肝細胞 Quick-Hepatocyte™ - SeV Complete Kit*2 センダイウイルスキット EXGS-QHSV 4 ウェル e-Nacalai.jpg
Quick-Hepatocyte™ - Maintenance Medium 維持培地 EXGS-QHM 4 ウェル分を
2 週間維持
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その他
試薬
Quick-Tissue™ Adaptatoin Kit StemFit®*4
培地への転換
EXGS-QTA1 1 ウェル*5 e-Nacalai.jpg
Quick-Tissue™ Mesoderm Booster 中胚葉への分化の加速 EXGS-QTMB 2 ウェル用チューブ 3 本 e-Nacalai.jpg
Quick-Tissue™ Endoderm Booster 内胚葉への分化の加速 EXGS-QTEB 2 ウェル用チューブ 3 本 e-Nacalai.jpg

*1 神経ミックスには GABA 作動性、ドーパミン、コリン作動性、グルタミン酸作動性、セロトニン神経が含まれます。
*2 カルタヘナ法該当
*3 96 ウェルプレートのウェル数
*4 StemFit® は味の素株式会社の登録商標です。
*5 6 ウェルプレートのウェル数

FAQ

分化誘導キット全般

ご質問回 答
培養 1 日目に球状のコロニーが見られます。 Coating Material A を室温で希釈、または室温の PBS を用いて希釈した可能性があります。Coating Material A と PBS の両方を氷冷後希釈してください。
培養 1 日目で細胞の多くが死滅していました。または浮遊した細胞や細胞破片が多く確認できました。 ヒト iPS 細胞を機械的に剥がして採取したため、傷ついた可能性があります。Solution D1 で剥離処理する際は、15 回上下にピペッティングしてください。
ヒト iPS 細胞を Solution D1 を用いて、こそぎ落とすこと無く解離させることが困難でした。 ウェル / ディッシュをコートする基質の濃度が高かった可能性があります。基質の濃度を 70% または 50% に下げてください。
指示通り細胞を植え込みしましたが、プロトコールに示されている培養 1 日目と比べると細胞密度が少なく見えました。 回収の際にヒト iPS 細胞が傷ついた可能性があります。プロトコールの指示に従って、Solution D1 を使用した後は、複数回のピペッティング操作を行い剥離するのが理想です。15 回以上ピペッティングが必要な場合、ウェル / ディッシュをコートする基質の濃度を 70% または 50% に下げてください。
細胞をウェルの側面には植え込みせず、中央にのみ植え込みしてしまいました。どう対処すればよいですか?

Nunc 社製の 4 ウェルプレートを使用時に、時折ウェルの周辺に細胞が植え込みできないことがあります。次回は以下を試してください。
1. 24 ウェルプレートを使用してください。
2. Coating Material A でコートしたプレートを 2 時間、37℃ で培養するところを、一晩、4℃ で培養してください。
3. プレートを扱う際は、ウェルの底面を指で触れないでください。

キットに含まれる構成品の容量が表示されている容量よりも少ないです。

キットに含まれるすべての試薬は必要量の 10% 増で提供されます。お使いのピペッターが調整されているか確認ください。また、components およびcoating materials はチューブの壁面に少量残っている可能性がありますので、遠心で落としてください。
ピペッターに問題がない場合は、弊社までお問い合わせください。

ヒト iPS 細胞の操作には慣れていません。合成 RNA キットとセンダイウイルスキットどちらのキットを使用するべきですか?

基本的な細胞培養の経験はあるが、ヒト iPS 細胞培養の経験が少ないお客様はセンダイウイルスベースのキットが適しています。
合成 RNA ベースのキットも取り扱いが簡単です。最初の 2 日間を、2 回連続で処理するのと培地交換を行うだけです。

合成 RNA キットとセンダイウイルスキットで分化効率に違いはありますか?

合成 RNA ベースとセンダイウイルスベースで分化効率に差はあまりありません。
Quick-Neuron™ Cholinergic 合成 RNA とセンダイウイルスの使用データでは、ヒト iPS 細胞から分化させた TUBB3 +ニューロンの割合はそれぞれ 93% と 88% でした。

キットを使用する前に、植え込み後のヒト iPS 細胞をどの程度維持させておく必要がありますか? ヒト iPS 細胞は、多能性が維持されていれば、ディスク状に密集しコロニーを形成します。1,000 細胞/cm2 を植え込みした場合、3~4 日でコロニーが形成されます。ヒト iPS 細胞が 80% コンフルエント状態に達すれば、その培養を使用するか、または継代を行ってください。
Elixirgen Scientific 社の分化誘導キットを購入する際には、ライセンス契約または同意書に署名する必要がありますか? 必要ありません。分化誘導キットを使用するのに、ライセンス契約または物質移動合意書(MTA)は不要です。しかし、これらの製品は研究目的での使用に限られます。
キットに必要な数以上のヒト iPS 細胞が回収できました。ヒト iPS 細胞を維持するために、残りのヒト iPS 細胞を再植え込みまたは凍結保存することはできますか? できません。
プロトコールの動画はありますか? あります。YouTube にアクセスしていただき、検索ボックスに「Elixirgen Scientific」と入力していただくと、Elixirgen Scientifics社の YouTube チャンネルが表示されます。すべてのキットに対して動画は用意されていませんが、さらに追加するよう努めています。

センダイウイルス分化誘導キット全般

ご質問回 答
培養 1 日目で細胞の多くが死滅している。または浮遊した細胞や細胞破片が多く見られます。 ヒト iPS 細胞とセンダイウイルスを激しく混合した可能性があります。ヒト iPS 細胞にセンダイウイルスを植え込みする際は、プレートを前後左右に傾けるように数回緩やかに揺らしてください。
ヒト iPS 細胞を 4 ウェル全てに植え込みした後にセンダイウイルスを添加してもいいですか? ヒト iPS 細胞を 1 ウェル植え込みするごとにセンダイウイルスを添加することを推奨します。しかし、プレートを前後左右に傾ける操作は 4 ウェル全てにセンダイウイルスを添加した後に行ってください。
プレートに植え込みする前にヒト iPS 細胞とセンダイウイルスを混合してもいいですか? 植え込みする前に混合しないでください。ヒト iPS 細胞とセンダイウイルスの相互作用は繊細で、植え込みする際のピペッティングで傷ついてしまいます。
小量のセンダイウイルスをどのように培地に添加すればいいですか? P20 ピペッターで、プランジャーをゆっくり押し下げると、ピペットチップにセンダイウイルス溶液が液滴となります。その液滴を培養液に触れさせる形で添加ください。さらに数回液滴を作り、均一にするためにも、培養液内の異なる箇所に添加ください。
ヒト iPS 細胞を回収した後、たくさんの細胞塊が見られます。 ヒト iPS 細胞を回収した後、細胞を回収チューブに 5 分以上放置しないでください。 より長い時間細胞を放置しますと細胞塊が形成され、センダイウイルスの感染を阻害する可能性があります。 感染には一つ一つの細胞に分かれている状態が適しています。
センダイウイルスにより宿主のヒト iPS 細胞のゲノム改変は起きますか? センダイウイルスは RNA ウイルスで細胞質内に留まるため、ゲノム改変は伴いません。
培養液中でセンダイウイルスの活性は維持されままですか? いいえ、使用するセンダイウイルスは温度感受性のため、33℃ では活性を保ちますが、37℃ では不活性化します。
センダイウイルスの使用は、研究施設の安全委員会からの承認が必要ですか? センダイウイルスの使用はカルタヘナ法に該当しますので、研究施設の遺伝子組換え安全委員会に承認を得ることが義務付けられています。センダイウイルスはヒトに対して病原性を示さず(すなわち、ヒトはセンダイウイルスの天然宿主ではない)、感染は免疫力を維持している動物では持続しません。さらに、Elixirgen Scientific 社のキットに使用されているセンダイウイルスは、宿主ヒト iPS 細胞への形質導入時に感染性ウイルス粒子を形成せず、また温度感受性変異体であり、33℃ では活性を保ちますが 37℃ で不活化します。しかし、センダイウイルスはエアロゾルや呼吸器分泌物との接触により感染が起こり、伝染性が高いため、起こりうるウイルスへの粘膜曝露を防ぐために適切な注意が払われる必要があります。
まとめますと、Elixirgen Scientific 社のセンダイウイルスベースのキットは、バイオセーフティーレベル 2(BL-2)の隔離の元、生物学的安全キャビネットまたは層流フード内で、適切な個人用保護具を着用して使用する必要があります。ウイルスが皮膚や目に触れた場合は、多量の水で洗い流して患部を直ちに除染し、研究室が作製し、また研究施設の安全委員会の承認を得た安全マニュアルに従って処置してください。

合成 RNA 分化誘導キット全般

ご質問回 答
なぜ合成 RNA ベースのキットは、StemFit® または StemFlex™ の培養条件下で維持されたヒト iPS 細胞を使用する必要があるのですか? これら 2 つの培養条件では、より低い密度でのヒト iPS 細胞の植え込み、あるいは単一のヒト iPS 細胞の効率の良い分裂増殖が可能であるため、Elixirgen Scientific 社の合成 RNA ベースのキットを用いた分化誘導を高い品質で行うことができます。 mTeSR1 または E8 条件下で維持されたヒト iPS 細胞は、Elixirgen Scientific 社のキットとは適合性がありません。ですので、Elixirgen Scientific 社の合成 RNA ベースのキットに使用する前に、StemFit® または StemFlex™ のいずれかの条件に切り替えて適応させる必要があります。
合成 RNA キットにより宿主のヒト iPS 細胞でゲノム改変は起きますか? いいえ、RNA はゲノム改変は伴わず、細胞質内に数時間留まります。
トランスフェクション試薬を別途購入する必要がありますか? いいえ、追加のトランスフェクション試薬は必要ありません。製品に含まれるトランスフェクション試薬をお使いください。
どのような RNA が分化誘導に使用されていますか? 知的財産権に基づいて処方された RNA であり、開示することはできません。

Quick-Neuron シリーズ

ご質問回 答
Coating Material B および C はどれくらいウェル内に放置できますか? Coating Material B と C は 37℃ で一晩ウェル内に放置することができます。
神経細胞の培養にはどの種類のカバーガラスが使用できますか? 高品質なドイツ製のホウケイ酸塩ガラスの使用が、教科書「Culturing Nerve Cells」で推奨されています。
Coating Material B および C で処理した後、カバーガラスを PBS で洗浄する操作は省いてもいいですか? いいえ、省かないでください。結合せずに残留している Coating Material B または C は、その後に続く Coating Material C および細胞の結合を弱めます。
プロトコール通りに Coating Material B を 150 µL 使用しましたが、カバーガラスが部分的にしか覆われていません。または Coating Material B がカバーガラス上に液滴のまま残っていませんでした。 150 µL の Coating Material B を追加で加えた後、2 時間ほど培養してください。
カバーガラスが Coating Material B または C の液面で浮いています。どうしたらいいですか? 培養を始める前に、カバーガラスが Coating Material B または C 内に沈んでいることを確認してください。プレートを緩やかに揺らすことで簡単にカバーガラスを溶液中に沈めることができます。または浮かんでいたカバーガラスは、片側はコーティングされているはずなので、裏返して使用することが可能です。
私はヒト iPS 細胞を運動ニューロンに分化させたいと考えています。 そのようなキットはありますか?

運動ニューロンがコリン作動性ニューロンに由来するため、Elixirgen Scientific 社の Quick-Neuron™ Cholinergic キットですと、ヒト iPS 細胞から運動ニューロンを分化させることができます。 Quick-Neuron™ Cholinergic キットを用いて分化させたニューロンは、運動ニューロンマーカーChAT を発現しています。以下の URL ご覧ください。
https://elixirgenscientific.com/store/quick-neuron-cholinergic/

Quick-Neuron センダイウイルス シリーズ

ご質問回 答
培養 3 日目の継代後に予想される分化効率はどのくらいですか? 継代した場合は、ほぼ純粋な神経細胞からなりますが、継代しない場合でも 80% 以上は神経細胞に分化します。
培養 1 日目で培養状態を確認すると、ヒト iPS 細胞が必要数よりも多いです。どうしたらいいですか? 神経細胞の分化があまり効率よく起こらずに前駆細胞の増殖が起こることが予想されますので、プロトコールの指示に従って 3 日目に継代を行ってください。 3 日目の継代は、継代後の培養中に占める神経細胞の割合を高くします。 また、Elixirgen Scientific 社のキットを再度ご使用する場合は、ウェルあたり 0.1、0.2、0.5、1.0 X 105 個の細胞を植え込みし、プロトコール中の培養開始 1 日目の画像と同様の細胞密度になる最良の細胞数を決定してください。

Quick-Neuron Mixed

ご質問回 答
Quick-Neuron™ Mixed を分化誘導に使用すると、どのような神経細胞が分化しますか?

以下のマーカーの発現を確認しています。
・コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT、コリン作動性ニューロンマーカー)
・チロシンヒドロキシラーゼ(TH、ドーパミン作動性ニューロンマーカー)
・パルブアルブミン(PVALB、GABA 作動性ニューロンマーカー)、小胞性グルタミン酸トランスポーター 1(vGLUT1、グルタミン酸作動性ニューロンマーカー)、トリプトファンヒドロキシラーゼ 2(TPH2、セロトニン作動性ニューロンマーカー)。
結果は以下のリンクでご確認いただけます。
https://elixirgenscientific.com/store/quick-neuron-mixed/

Quick-Endothelium™ Vascular - mRNA Complete Kit with Optional Drug Selection

ご質問回 答
培養 1 日目で培養状態を確認すると、ヒト iPS 細胞が必要数よりも多いです。どうしたらいいですか? プロトコール通り QEV 処理を進めてください。培養 1 日目と培養 2 日目の QEV 処理後に、死滅曲線に基づいて決定されたピューロマイシンの最適濃度よりも 1.5 または 2.0 倍量のピューロマイシンを加えてピューロマイシンセレクションを実施ください。
培養 3 日目で細胞がほとんど見られません。どうしらたらいいですか? 最初の細胞の植え込みが最適な条件より低密度だった可能性があります。再度行う際は、培養 0 日目に植え込みするヒト iPS 細胞の数を、4-well プレートの 1 ウェルあたり 1.6、1.8、2.0、2.2 X 105 cells/well で試してください。
血管内皮細胞に分化していますが、細胞密度がほぼ 100% コンフルエント状態です。継代した方がよいですか? 100% コンフルエント状態に達するまでに継代することをお薦めします。Quick-Endothelium Vascular Maintenance Medium (#EXGS-QEVM)のプロトコールに従ってください。

Quick-Muscle™ Skeletal - SeV Complete Kit

ご質問回 答
培養 5 日目または培養 6 日目で細胞をほとんど確認できませんが、紡錘型の細胞が少しみられます。 最初の細胞の植え込みが最適な条件より低密度だったと考えられます。再度行う際は、培養 0 日目に植え込む細胞の数を、4-well プレートの 1 ウェルあたり 1.4、1.6、1.8、2.0 X 105 cells/well に増やしてください。
培養 5 日目または培養 6 日目には紡錘型の細胞が見られますが、ウェルの周辺には多数の未分化細胞も見られます。

最初の細胞の植え込みが最適な条件より高密度だったと考えられます。再度行う際は、培養 0 日目に植え込む細胞の数を、4-well プレートの 1 ウェルあたり 0.3、0.4、0.5、0.6 X 105 cells/well に減らしてください。
または、Mesoderm Booster が、解凍直後に使用されなかったと考えられます。 指示に従って Mesoderm Booster を使用してください。

培養 5 日目または培養 6 日目で紡錘型の細胞がウェルの片側にしかみられません。 QMS-SeV と Mesoderm Booster が培地と均一に混合されなかったと考えられます。QMS-SeV 添加後は、プレートを数回緩やかに揺らしてください。また Mesoderm Booster を添加後は、培養する前にプレートを 15 秒円を描くように攪拌してください。

Quick-Hepatocyte™ - SeV Complete Kit

ご質問回 答
KSR を使用する必要はありますか? FBS を代用で使用できますか? FBS を使用すると分化効率が下がりますので、KSR を使用してください。
プロトコール掲載の培養 1 日目と比べると細胞の数が少ないです。分化誘導はできますか? 分化効率は低下すると考えられます。再度キットを使用する場合、4-well プレートの 1 ウェルあたり 1.5、2.0、2.5、3.0 X 105 cells/well の細胞を植え込みし、プロトコールに掲載の培養 1 日目の画像を参考に最適な細胞数を判断してください。
※記載の内容は、'18 年 7 月現在の情報に基づいております。