おすすめ製品

Olink Bioscience社　Duolink® 

Olink Bioscience社

Olink Bioscience社（スウェーデン）は、1分子レベルでターゲットタンパク質を特異的に検出する独自の増感技術(PLA: Proximity Ligation Assay)を有しています。
PLA法は高感度な検出が可能なだけでなく、使用する一次抗体の選択により、細胞や組織の内在性タンパク質の相互作用や局在、翻訳後修飾などを検出できる画期的な検出方法です。
注）掲載のデータは主に旧製品のDuolink®で取得したものです。

2012年4月1日より品名変更となりました。
Duolink®Ⅱ→Duolink® In Situ

特長

  • 内在性タンパク質の二分子間相互作用や局在、翻訳後修飾などの解析が可能
  • 検出しにくい内在性タンパク質の検出も可能
  • 検出されたドットをカウントすることで、定量的な発現・相互作用解析が可能
  • ハイスループットスクリーニング（HTS）への応用も可能
|使用例1.Olink社　Duolink® in situ PLATM を用いたFOXO1と14-3-3の相互作用局在解析法| 原理| アプリケーション | 検出法の比較| 使用例2.二分子間相互作用の検出|発色検出法 |　HTSへの応用 | 製品選択 | 関連製品 |　使用実績 |　Q＆A | 価格表 |

使用例1

Olink社　Duolink®　in situ PLATM を用いたFOXO1と14-3-3の相互作用局在解析
実験概要
血清存在下において、転写因子FOXO1は細胞質に局在し、アダプタータンパク質14-3-3と結合しているが（図 C）、PI3K阻害剤LY294002の添加により、FOXO1は14-3-3タンパク質から解離し、核移行することが知られている（図D）。本実験で は、Duolink® in situ PLATM を用いて、LY294002処理前後における両者の結合状態の変化をモニターした。
実験方法
細胞： HEK293 cell
固定条件： 4% PFA
一次抗体： FOXO1（C29H4） Rabbit mAb （Cell Signaling Technology 製品番号 2880）
pan 14-3-3（H-8） Mouse mAb （Santa Cruz 製品番号 sc-1657）
Duolink® の組み合わせ：
Duolink® PLATM probe anti-Mouse MINUS
Duolink® PLATM probe anti-Rabbit PLUS
Duolink® Detection Kit 613
顕微鏡： Fluoview FV10i （オリンパス）
結果・考察
Duolink® in situ PLATM を用いて、FOXO1および14-3-3の結合を検出したところ、すでに報告されているとおり血清存在下では、両者の結合が細胞質で検出され（図A）、LY294002の添加により両者の結合が減少した（図B）ことが明らかとなった。
データご提供：筑波大学大学院　生命環境科学研究科　生物機能科学専攻 吉用　賢治　学振特別研究員／大徳　浩照　講師／深水　 昭吉　教授

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原理

PLA（Proximity Ligation Assay）法

PLA法の原理について二分子間相互作用を検出する場合を基にご紹介します。まず、相互作用している2種類のタンパク質にそれぞれを検出する一次抗体*1を作用させます。ただし、用いる2種類の抗体は、免疫動物種（mouse、rabbit、goat）が異なっていなければなりません*2。 次に、一次抗体の免疫動物種に対応した二次抗体のセットを作用させます。二次抗体には特殊な核酸が連結しており、二つの異なる二次抗体同士が近接（約 40nm）した場合に核酸のライゲーション反応が生じ、環状構造を形成します。さらに、ポリメラーゼを反応させることにより、環状構造に沿って一本鎖の核 酸を伸長させます。伸長させる核酸内には特定の
リピート配列が組み込まれるようになっており、蛍光標識またはHRP標識*3された相補的な核酸が、その配列へハイブリダイゼーションします。以上の方法により2種のタンパク質の相互作用を検出します。

図1.一次抗体と二次抗体の結合

サンプルをブロッキングした後、検出目的のタンパク質を検出する免疫動物の異なる2種類の一次抗体*2をサンプル（組織、細胞等）とインキュベーションします。
次にDuolink®  In Situ PLA® probe　MINUSおよびDuolink®  In Situ PLA® probe PLUS (オリゴヌクレオチドを連結した二次抗体)溶液を添加後インキュベーション（37℃、60分）します。

図2.PLAプローブのハイブリダイズとライゲーション反応

2種類のオリゴを含有しているLigation solutionを添加し、インキュベーション（37℃、30分）することで、環状構造が形成されます。

図3.伸長反応と標識プローブのハイブリダイズ

Amplification solutionを添加し、インキュベーション（37℃、100分）すると、環状構造に沿って一本鎖の核酸が伸長されます（RCA法）。この反応液には蛍 光標識されたオリゴヌクレオチドプローブが含まれており、伸長した核酸へハイブリダイズします。HRP標識されたプローブを用いて発色基質を使用して、光 学顕微鏡(明視野)で検出するシステムもあります。）

図4.封入剤処理と解析

Duolink®  In Situ Mounting Medium with DAPI (別売り： 82040-0005)でサンプルを封入した後、蛍光顕微鏡で解析します。

*1 一次抗体はお客様でご用意ください。Single Recognition法の場合、1種類の一次抗体を作用させます。
*2 Probemakerを使用することで同じ免疫動物種由来の抗体でも使用可能になります。
*3 HRP標識された核酸を用いる場合、HRPに対する発色基質を用いて検出します。

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アプリケーション

二分子間相互作用の検出
二分子間相互作用の検出
＜方法＞
それぞれのターゲットタンパク質に結合する2種類の一次抗体を使用

＜アプリケーション例＞
・タンパク質相互作用を検出
・複合体の局在化を検出

二分子間相互作用の検出
詳細はこちら
SMAD1/2/3とSMAD4に対する2種類の一次抗体と 本システムを使用して検出（オレンジ色のドット）、サンプル：マウス胎児線維芽細胞をTGF-βで刺激後、検出
りん酸化タンパク質の検出
りん酸化タンパク質の検出
＜方法＞
一次抗体の一方にターゲットタンパク質のりん酸化部位を認識する抗体を使用

＜アプリケーション例＞
・翻訳後修飾タンパク質を検出
・翻訳後修飾タンパク質の局在化を検出

りん酸化タンパク質の検出
詳細はこちら
phospho-PDGFとPDGF-β受容体 に対する2種類の一次抗体と本システムを使用して検出（赤色のドット）、サンプル：BJ hTert細胞をPDGF-BBで刺激後、検出
タンパク質発現の検出（Single Recognition）
高感度検出
＜方法＞
1つのターゲットタンパク質に対し、1種類の一次抗体のみ使用

＜アプリケーション例＞
・タンパク質局在化を検出

高感度検出
詳細はこちら
EGFRに対する1種類の一次抗体と本システムを使用して検出（赤色のドット）、サンプルA431細胞
タンパク質発現の検出（Double Recognition）
高特異性・高感度検出
＜方法＞
1つのターゲットタンパク質に対し、エピトープの異なる2種類の一次抗体を使用

＜アプリケーション例＞
・タンパク質局在化を検出
高特異性・高感度検出
詳細はこちら
HER2に対する2種類の一次抗体と本システムを使用して検出（オレンジ色のドット）、サンプル：MDA175細胞

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検出法の比較

本システムは、従来のFRET/BRETなどの蛍光ベースのタンパク質相互作用解析や共免疫沈降法とは異なり、細胞や組織など多様なサンプルについて、内在性タンパク質の相互作用、局在など様々な情報を一度に得ることができます。

Objective/TechniqueDuolink®Co-localizationCo-immunoprecipitationBRETFRET
Detect single molecules
Detect in situ
Study endgenous proteins
Analyze protein interaction
Analyze archived tissue
Obtain objective,
quantifiable result

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使用例2

二分子間相互作用の検出

SMAD1/2/3-SMAD4の相互作用解析
SMAD1/2/3-SMAD4の相互作用解析
蛍光染色データとイメージ解析

上段のデータ(A, B)は、本システムを使用しマウス胎児線維芽細胞をTGF-βで未刺激(A)と45分間刺激(B)したサンプルに関する検出結果を示している。 SMAD1/2/3に対する一次抗体（マウス由来）、SMAD4に対する一次抗体（ラビット由来）と本システムを用いて検出されたシグナルは、オレンジ色 のドットで示されている。核はHoechst 33342（青色）、アクチンはFITC-抗アクチン抗体（緑色）で染色されている。
下段のデータ(C, D)は、上段のデータをMatlab image analysis softwareを用いて、イメージ解析したデータを示している。TGF-β刺激を行ったサンプルは、SMAD1/2/3とSMAD4の相互作用が生じ、 複合体が核に移行することが示されている。（図中の白色のドット）。

＜使用した検出システム＞
  • Duolink® in situ PLATM probe anti-mouse MINUS
  • Duolink® in situ PLATM probe anti-rabbit PLUS
  • TexasRed®標識されたプローブ（Ex/Em：583/603）
SMAD1/2/3-SMAD4の相互作用解析
核と細胞質における相互作用の比較

SMAD1/2/3-SMAD4相互作用を表すシグナルの数をカウントし、核と細胞質のそれぞれに分類しグラフにプロットした。65個のTGF-β未刺激の細胞（■）と60個の刺激した細胞（▲）が解析された。このデータによりTGF-βで刺激した細胞は、SMAD1/2/3-SMAD4複合体が核に移行することが示されている。
HER2-EGFRの相互作用解析
HER2-EGFRの相互作用解析
蛍光染色データとイメージ解析

本システムを使用しSK-BR-3細胞における、HER2-EGFRの相互作 用を検出した結果を示している。左側のデータ(A)は、HER2に対する一次抗体（ラビット由来）、phospho-EGFRに対する一次抗体（ヤギ由 来）と本システムを用いて検出されたシグナルの画像（赤色のドット（575/605 Filter使用））と青色で染色される核の染色画像（Hoechst 350/461 Filter使用）を重ね合わせたデータである。データ中の数字は、細胞集団の中で任意に付けた数字である。右側のデータ（B）は、BlobFinder*)イ メージ解析プログラムを用いて計測されており、本システムにより検出されたシグナル（白色のドット）は、細胞とバックグラウンドの双方に起因している。核 の周辺部分（緑色の縁取り）の任意の部分（黄色と緑色の間の部分）で検出されているシグナルは細胞に起因していることを示す一方、境界線の外側および核に 近接してないシグナルは、バックグラウンドに起因している。

＜使用した検出システム＞
  • Duolink® in situ PLATM probe anti-mouse MINUS
  • Duolink® in situ PLATM probe anti-goat PLUS
  • TexasRed®標識されたプローブ（Ex/Em：583/603）
*)BlobFinderは機能アップしDuolink® ImageToolとして販売しています。詳細はこちらをご覧ください。



りん酸化タンパク質の検出

内在性レベルのPDGF受容体-βのりん酸化レベルの検出
内在性レベルのPDGF受容体-βのりん酸化レベルの検出
蛍光染色データ

本システムを使用しBJ hTert細胞をPDGF-BB未刺激（A）と60分間刺激（B）したサンプルに関する検出結果を示している。phospho-PDGFに対する一次抗体 (マウス由来)、PDGF受容体-βに対する一次抗体(ラビット由来)と本システムを用いて検出されたシグナルは、赤色のドットで示されている。核は Hoechst 33342(青色)で染色されている。本システムを使用することで、内在性タンパク質のりん酸化レベルを比較検討できることを示している。

＜使用した検出システム＞
  • Duolink® in situ PLATM probe anti-mouse MINUS
  • Duolink® in situ PLATM probe anti-rabbit PLUS
  • TexasRed®　標識されたプローブ（Ex/Em：583/603）

細胞1個あたりのりん酸化のレベルとその集団の割合

細胞1個あたりのりん酸化のレベルとその集団の割合

1個の細胞あたりのりん酸化された受容体の数

PDGF受容体-βのりん酸化の定量について、BlobFinder*）ソフトウェアにより、239個の未刺激の細胞と275個のPDGF-BB刺激処理を行った細胞のヒストグラム。刺激に応じて、りん酸化された受容体のレベルが上昇することが示されています。
*)BlobFinderは機能アップしDuolink® ImageToolとして販売しています。詳細はこちらをご覧ください。

タンパク質発現の検出と定量(Single Recognition法)
siRNA効果の検出への応用
siRNA効果の検出への応用（高感度検出）
SMAD4の発現抑制の検出

マウス胎児線維芽細胞におけるSMAD4に対するsiRNAの発現抑制を示し ている。SMAD4に対して、siRNAを添加した場合（A）と未処理の場合（B）におけるSMAD4の発現を本システムにより検出したデータである。一 次抗体は、マウス由来のSMAD4抗体を用いた。1分子レベルで検出されたSMAD4は、赤色のドットとして検出されている。核はHoechst 33342（青色）で染色されている。

＜使用した検出システム＞
  • Duolink® in situ PLATM probe anti-mouse MINUS
  • Duolink® in situ PLATM probe anti-mouse PLUS
  • Duolink® Detection kit 563 (Ex/Em：557/563)
1個の細胞あたりの検出シグナル数の比較
1個の細胞あたりの検出シグナル数の比較

データはsiRNAを添加した場合と未処理の場合の細胞1個あたりのシグナルの数を示している。siRNAを添加した細胞では、シグナルの数が1〜10個と減少しており、本システムによりsiRNAの効果を検出できることを示している。

ウェスタンブロッティングの結果との相関

siRNAを添加した場合（A）と未処理の場合(B)の細胞をそれぞれ回収し、ウェスタンブロッティング解析を行った結果を示している。Duolink®システムの検出結果とウェスタンブロッティングの検出結果は相関性がある事を示している。

siRNA研究におけるDuolink® の利点

方法 正確な定量性 タンパク質発現
レベルでの検出		 局在化解析 1個の細胞レベル
での解析		 微量サンプル
への適応
Real-time PCR ○ × × × ×
ウェスタン
ブロッティング		 ○ ○ × × ×
免疫染色 × ○ ○ ○ ○
Duolink® システム ○ ○ ○ ○ ○

Duolink® システムは、1個の細胞についてタンパク質レベルで解析できることから、従来のsiRNAの評価方法と比較し、微量のサンプルから様々な情報を得ることが可能です。



タンパク質発現の検出と定量(Single Recognition法)

EGFRに対する従来の免疫組織染色法との比較
サンプル（一次抗体あり）　　 コントロール（一次抗体なし）
EGFRに対する従来の免疫組織染色法との比較

一次抗体として、マウス由来のEGFR抗体を用い、本システム（A）と従来の免疫蛍光染色(C)の結果を比較している。従来の免疫蛍光染色には、ロバ由来のTexasRed® 標識抗マウスIgG抗体を二次抗体として用いた。サンプルはA431細胞を用いている。これらの結果から、本システムを用いたサンプルはタンパク質を1分 子レベルでドット検出され定量化可能である。一方、従来の免疫蛍光染色は、シグナルが拡散し1分子レベルで検出不可能である。また、コントロールに関して も、本システムを用いた場合(B)は、バックグラウンドシグナルが検出されないが、従来の免疫染色法（D）では検出されている。

＜使用した検出システム＞
  • Duolink® in situ PLATM probe anti-mouse MINUS
  • Duolink® in situ PLATM probe anti-mouse PLUS
  • Duolink® Detection kit 613(Ex/Em：598/613)

タンパク質発現の検出と定量(Double Recognition法)

2種類の抗体を用いたHER2の検出
新しい検出試薬：Detection kit 563を用いたHER2の検出
蛍光染色データ

HER2抗体（マウス由来、ラビット由来の2種類の一次抗体）を用いた本システムの使用結果を示している。HER2に対する一次抗体と本キットを用いて検出されたシグナルは、オレンジ色のドットとして検出されている。
サンプルは、MDA175細胞（+1レベル）を用いた。

＜使用した検出システム＞
  • Duolink® in situ PLATM probe anti-mouse MINUS
  • Duolink® in situ PLATM probe anti-rabbit PLUS
  • Duolink® Detection kit 563 (Ex/Em：557/563)

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発色検出法

光学顕微鏡観察

Duolink®  In Situ Detection Reagents Brightfield
本製品は検出プローブがHRP標識されており、発色基質を使用することで、光学顕微鏡(明視野)を用いて、ターゲットタンパク質の相互作用や局在等を解析することができます。
A B
肝臓がん組織(A)と健常な肝臓組織(B)をサンプルとしてHER受容体を検出した（茶褐色のドット）。
この結果は、がん組織でHER受容体が多く発現していることを示している。
＜使用した検出システム＞
  • Duolink® Detection kit HRP/NovaRED

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HTSへの応用

本システムは、通常プロトコールを少し変更することで、マイクロプレートでも使用することができます。内在性タンパク質の翻訳後修飾や相互作用に影響を与える化合物のスクリーニングに最適です。通常プロトコールと比較した主な変更点・注意点を下記に挙げます。

インキュベーション
  • 乾燥しないようにプレートのふたやパラフィルム等でウェルを覆う。
  • 反応を均一にさせるためにオービタルシェーカーの使用をおすすめします。
  • ウェル/プレート間で温度条件に差が出ないよう、インキュベーション時はDuolink®  In Situ Heat TransferBlockの使用をおすすめします。
洗浄操作
  • ウェル内の洗浄バッファーはできるだけ除く（サンプルが乾かないように注意する）
観察
  • 退色防止/核染色剤としてDuolink®  In Situ Microplate Nuclear Stain and AntiFadeを使用する。
  • 倍率20x以上、解像度0.25μm/pixel(少なくとも0.45μm/pixel)でデータを取得する。

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製品選択

本システムでは、Probe MINUS、Probe PLUS、Detection Reagentsが必要となります。Probe MINUSとProbe PLUSはそれぞれ3種×4容量、Detection Reagentsは4種×4容量のラインアップになっています。各々からお客様の実験に適したものを1種ずつお選びください。容量はそれぞれ30回、100回、500回、1000回です。なお、Probe MINUS、Probe PLUS、Detection Reagentsが一緒になっているスターターキットもございます。同スターターキットは30回用で、他にDuolink® In Situ Wash Buffers for FluorescenceとDuolink® In Situ Mounting Medium with DAPIが同包されており、大変お得です。

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関連製品

Duolink®  In Situ Probemaker
本製品を用いて直接一次抗体、または、お好きな二次抗体へPLA® probe（MINUSとPLUS）を連結することができます。これにより、Duolink® In Situ PLA® probeのラインアップに目的の二次抗体が無い場合、ホモダイマーを検出する場合、用いる2種類の一次抗体が同じ免疫動物由来の場合でもDuolink® In Situ Detection Reagentsを使用することができるようになります。
①既製 PLA®probeに目的の二次抗体が無い場合
既製PLA®probe（二次抗体）に、お持ちの一次抗体が適合しない場合でも、二次抗体を標識することでどのような免疫動物種由来の一次抗体でもご利用可能です。
注）既製probe抗体の免疫動物はDonkeyなので、Donkey IgGを認識する抗体probeと既製PLA®probeを一緒に使用することはできません。
②ホモダイマーを検出する場合
1種類のモノクローナル抗体をPLUSとMINUSで別々に標識することで可能です。
③免疫動物種が同じ抗体をprobeとして使用する場合
PLA標識二次抗体を使用せず、一次抗体を直接標識することで、免疫動物種が同じでも問題なく使用できるようになります。
 
  
使用例　　りん酸化EGFレセプターの検出 
 
A431細胞(A) rhEGF無添加 (B)rhEGF処理2min
抗EGFレセプター抗体と抗りん酸化チロシン抗体それぞれにPLA® probeを連結して検出に使用した。（緑：抗アクチン抗体、青：DAPI） 


Duolink® ImageTool
本製品は、Duolink®システムを用いて得られた実験結果の画像処理、およびその結果の数値化が容易に行えます。解析後、数値データはExcel等で使用できるテキストファイルとして、画像はTIF、JPEG、PNG、BMPファイルとして出力できます。また、Olink社では本製品のデモバージョンを用意しており、同社webサイトよりダウンロードが可能です。なお本デモバージョンには、機能制限が設けられています。http://www.olink.com/
  • 自動で核を検出し、核の数、核の面積、シグナル強度を測定
  • 各細胞あたりのシグナル数を計測
  • 対応OS：Windows® XP 、　Windows Vista® 、Windows® 7
機能制限の無いフルバージョンでのデモをご希望される場合は、販売店または弊社営業所までご連絡ください。

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使用実績

二分子間相互作用の検出・定量 1 Prox1 COUP-TFII HDLEC（ヒト皮膚リンパ管内皮細胞）
2 PML AKT RS4:11（ヒト前駆B細胞性白血病細胞株）
3 pVHL Sp1 ヒト角化細胞
4 Dyx1c1 Erα ラット海馬神経細胞
5 Integrin α5 ZO-1 NCI-H460（ヒト肺がん細胞）
6 NRP1 β3-integrin HUVEC
7 PDGFRβ PI3 kinase ヒト繊維芽細胞
8 periostin Tenascin-C C3H10T1/2（マウス間葉系細胞株）
9 Hsp104p Actin 酵母
10 Osteopontin CD44 ヒト消化管間質腫瘍
11 VEGFR-2 VEGFR-3 マウスEmbryoid body
ヒト伏在静脈血管内皮細胞
12 53BP1 ΔNp73 U2OS（ヒト骨肉種細胞株）
13 HSP90α Neu HCT-8（ヒト大腸がん細胞）
14 Dnmt1 PCNA ヒトastrocyte
15 NS5A NS3 Huh7.5.1（ヒト肝がん細胞）
16 ezrin Dlg1 Jurkat
17 zFxyd11 Na+-K+-ATPase ゼブラフィッシュの鰓
18 PDGFRβ PDGF-B マウス脳
19 P1 HC-Pro BY2細胞（タバコ培養細胞）
20 TACSTD2 CLDN1 ヒト角膜
21 Ncl 4Oct ヒトES細胞
マウスES細胞
22 WAVE Abi wing imaginal disc（翅原基）
リン酸化タンパク質の検出・定量 23 リン酸化LC20 − A7r5 （ラット大動脈平滑筋細胞）
24 リン酸化ERK − MCF-7（ヒト乳がん細胞）
タンパク質発現の検出・定量（Single Recognition） 25 ANXA7 − ヒト癌組織
26 Angiopoietin-1 − ヒヒ子宮内膜
タンパク質発現の検出・定量 （Double Recognition） 27 FLCN − マウス腎臓
 28 CEACAM1 − ヒト大腸癌組織
Duolink®
アプリケーション		 文献ID 検出タンパク質１ 検出タンパク質２ 使用サンプル
文献一覧
 1 Yamazaki, T. et al. COUP-TFII regulates the functions of Prox1 in lymphatic endothelial cells through direct interaction. Genes Cells 14(3), 425-434 (2009). 
2 Laane, E. et al. Cell death induced by dexamethasone in lymphoid leukemia is mediated through initiation of autophagy. Cell Death Differ. 16(7), 1018-1029 (2009).
3 Tan, S. H. et al. Regulation of cell proliferation and migration by TAK1 via transcriptional control of von hippel-lindau tumor suppressor. J. Biol. Chem. 284(27), 18047-18058 (2009).
4 Massinen, S. et al. Functional interaction of DYX1C1 with estrogen receptors suggests involvement of hormonal pathways in dyslexia. Hum. Mol. Genet. 18(15), 2802-2812 (2009).
5 Tuomi, S. et al. PKCε regulation of an α5 Integrin-ZO-1 complex controls lamellae formation in migrating cancer cells. Sci. Signal 2(77), ra32 (2009).
6 Robinson, S. D. et al. αvβ3-Integrin limits the contribution of Neuropilin-1 to VEGF-induced angiogenesis. J. Biol. Chem. 284(49), 33966-33981 (2009).
7 Leuchowius, K. J. High content screening for inhibitors of protein interactions and post-translational modifications in primary cells by proximity ligation. Mol. Cell. Proteomics. 9(1), 178-183 (2010).
8 Kii, I. et al. Incorporation of tenascin-C into the extracellular matrix by periostin underlies an extracellular meshwork architecture. J. Biol. Chem. 285(3), 2028-2039 (2010).
9 Liu, B. et al. The Polarisome is required for segregation and retrograde transport of protein aggregates. Cell 140(2), 257-267 (2010).
10 Hsu, K. H. et al. Clinical implication and mitotic effect of CD44 cleavage in relation to Osteopontin/CD44 interaction and dysregulated cell cycle protein in gastrointestinal stromal tumor. Ann. Surg. Oncol. 17(8):2199-212 (2010).
11 Nilsson, I. et al. VEGF receptor 2/-3 heterodimers detected in situ by proximity ligation on angiogenic sprouts. EMBO J. 29(8):1377-88 (2010).
12 Wilhelm, M. T. et al. Isoform-specific p73 knockout mice reveal a novel role for {Delta}Np73 in the DNA damage response pathway. Genes Dev. 24(6): 549-60 (2010).
13 Chen, J. S. et al. Secreted heat shock protein 90{alpha} induces colorectal cancer cell invasion through CD91/LRP-1 and NF-{kappa}B-mediated integrin {alpha}V expression. J. Biol. Chem. 285(33):25458-66 (2010).
14 Hervouet, E. et al. Disruption of Dnmt1/PCNA/UHRF1 interactions promotes tumorigenesis from human and mice glial cells. PLoS One 5(6):e11333 (2010).
15 Chen, Y. J. et al. Heat shock protein 72 is associated with the hepatitis C virus replicase complex and enhances viral RNA replication. J. Biol. Chem. 285(36):28183-90 (2010).
16 Lasserre, R. et al. Ezrin tunes T-cell activation by controlling Dlg1 and microtubule positioning at the immunological synapse. EMBO J. 29(14):2301-14 (2010).
17 Saito, K. et al. Identification of zebrafish FXYD11a protein that is highly expressed in ion-transporting epithelium of the gill and skin and its possible role in ion homeostasis. Front. Physio. 1:129 doi: 10.3389/fphys (2010).
18 Winkler, E. A. et al. Pericyte-specific expression of PDGF beta receptor in mouse models with normal and deficient PDGF beta receptor signaling. Mol Neurodegener. 5:32 (2010).
19 Nakahara, K. S. et al. Involvement of the P1 cistron in overcoming eIF4E-mediated recessive resistance against clover yellow vein virus in pea. Mol Plant Microbe Interact. 23(11):1460-9 (2010).
20 Nakatsukasa, M. et al. Tumor-associated calcium signal transducer 2 is required for the proper subcellular localization of claudin 1 and 7: implications in the pathogenesis of gelatinous drop-like corneal dystrophy. Am J Pathol. 177(3):1344-55 (2010).
21 Johansson, H. et al. Phosphorylated nucleolin interacts with translationally controlled tumor protein during mitosis and with Oct4 during Interphase in ES cells. PLoS One. 5(10):e13678 (2010).
22 Gohl, C.et al. WAVE Forms Hetero- and Homo-oligomeric Complexes at Integrin Junctions in Drosophila Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation. J. Biol. Chem. 285(51):40171-9 (2010).
23 Nakakuki, T. et al. Ligand-specific c-Fos expression emerges from the spatiotemporal control of ErbB network dynamics. Cell. 141(5):884-896.(2010).
24 Vetterkind, S. et al. Par-4: A new activator of myosin phosphatase. Mol Biol Cell. 21(7):1214-24 (2010).
25 Yadav, A. K. et al. Monosomy of chromosome 10 associated with dysregulation of epidermal growth factor signaling in glioblastomas. JAMA 302(3), 276-289 (2009).
26 Bonagura, T. W. et al. Divergent regulation of angiopoietin-1 and -2, Tie-2, and thrombospondin-1 expression by estrogen in the baboon endometrium. Mol. Reprod. Dev. 77(5):430-8. (2010).
27 Hasumi, Y. et al. Homozygous loss of BHD causes early embryonic lethality and kidney tumor development with activation of mTORC1 and mTORC2. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 106(44), 18722-18727 (2009).
28 Ieda, J. et al. Re-expression of CEACAM1 long cytoplasmic domain isoform is associated with invasion and migration of colorectal cancer. Int J Cancer. 2011 Mar 16. doi: 10.1002/ijc.26072.

今までに使用された抗体やサンプル、そしてターゲットやアッセイ条件等が一覧になっているDuolink Assay DatabaseがOlink社webサイト（http://www.olink.com/）にございます。参考情報としてご覧ください。


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Q＆A

質問 回答
Single Recognition法とDouble Recognition法の違いは何ですか？ Single Recognition法では1種類の一次抗体を使用して高感度検出が可能です。一方、Double Recognition法では2種類の一次抗体を使用して特異性の高い検出が可能です。
Duolink® システムの使用条件はありますか？ 本システムは免疫染色で機能する一次抗体が必要です。加えて、事前に一次抗体が機能する条件を確定しておく必要があります。
どのようなサンプルで使用できますか？ 本システムは、固定した細胞やホルマリン固定パラフィン包埋した組織等の様々なサンプルに使用可能です。
生細胞で使用することはできますか？ 本システムは固定化処理をしたサンプルを対象としていますので、生細胞では使用することができません。
サンプルの前処理で制約はありますか？ 抗原の賦活化は、一般的な熱処理とProteinase Kを用いた処理法で問題ありません。固定化は、パラホルムアルデヒド、ホルマリン、亜鉛、エタノール、アセトンなどを用いる様々な方法が適用可能です。
自前のブロッキング溶液は使用できますか？ 免疫染色で現在使用されているブロッキング溶液を本システムでも使用して頂けます。一次抗体の使用において、特にブロッキング溶液が限定されていない場合は、製品添付のブロッキング溶液をご使用ください。
退色防止剤は何を使用すればいいですか？ 蛍光検出用にDuolink®  In Situ Mounting Medium with DAPI、発色検出用にDuolink®  In Situ Brightfield Mounting Medium、マイクロプレート(HTS)用にDuolink®  In Situ Microplate Nuclear Stain and Anti-Fadeをご使用ください。
洗浄バッファーは何を使用すればいいですか？ マニュアルに従って作製して頂くか、製品（Duolink®  In Situ Wash Buffer for Fluorescenceあるいはfor Brightfield）をご購入ください。
PLA 標識二次抗体について教えてください。 販売しているPLA® probe（二次抗体）の免疫動物はDonkeyですので、Duolink®  In Situ Probemaker で作成したprobeと組み合わせて使用する場合、標識する二次抗体は抗Donkey IgG抗体以外をご使用ください。PLA® probe anti-MouseはRat IgGと交差性がありますのでご注意ください。
使用予定の一次抗体に適したPLA® probe (PLA標識二次抗体) 製品がありません。 お好きな二次抗体へPLA® probeを標識するDuolink®  In Situ Probemaker をご利用し、標識してください。
ヘテロダイマーの検出で注意することはありますか？ 各タンパク質に用いる一次抗体は宿主が異なるものを使用してください。
同じ宿主由来の抗体を用いる場合はDuolink®  In Situ Probemakerをご利用ください。
ホモダイマーの検出はできますか？ 下記2種類の方法で検出できます。
1) 1種類の一次抗体をDuolink®  In Situ Probemaker を用いてMINUSとPLUSそれぞれで標識する。
2) 同じエピトープを認識するが宿主の異なる2種類の一次抗体を使用する。この場合は特異性の高い抗体で最適化（一方の抗体の結合量が過剰とならないような濃度の条件検討）する必要があります。
HTS解析に応用できますか？ できます。「HTSへの応用」をご覧ください。
サンプル由来の核酸へ標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズしませんか？ 可能性はありますが、RCA法により増幅された核酸に比べて、サンプル由来の核酸へハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチドのシグナル強度は非常に弱いと考えられることから問題ありません。
容量の単位は”reactions”ですが、定義は何ですか？ 1cm2の反応を1 reactionとしています。

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価格表

製品名 メーカー
製品番号		 容量 価格 買い物
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■Starter Kit    
Duolink®  In Situ Rabbit/Mouse Red Starter Kit
キット内容：PLA® probe anti‐Mouse MINUS(5ｘ), PLA® probe anti‐Rabbit PLUS(5ｘ),Duolink®  In Situ Detection Reagents Red,Duolink®  In Situ Wash Buffers for Fluorescence,Duolink® In Situ Mounting Medium with DAPI		 92101 30 reactions 186,000
Duolink®  In Situ Mouse/Goat Red Starter Kit
キット内容：PLA® probe anti‐Goat MINUS(5ｘ), PLA® probe anti‐Mouse PLUS(5ｘ),Duolink®  In Situ Detection Reagents Red,Duolink®  In Situ Wash Buffers for Fluorescence,Duolink®  In Situ Mounting Medium with DAPI		 92103 30 reactions 186,000
Duolink II Goat/Rabbit Red Starter Kit
キット内容：PLA® probe anti‐Rabbit MINUS(5ｘ), PLA® probe anti‐Goat PLUS(5ｘ),Duolink®  In Situ Detection Reagents Red,Duolink®  In Situ Wash Buffers for Fluorescence,Duolink® In Situ Mounting Medium with DAPI		 92105 30 reactions 186,000
Duolink®  In Situ Rabbit/Mouse Orange Starter Kit
キット内容：PLA® probe anti‐Mouse MINUS(5ｘ), PLA® probe anti‐Rabbit PLUS(5ｘ),Duolink®  In Situ Detection Reagents Orange,Duolink®  In Situ Wash Buffers for Fluorescence,Duolink®  In Situ Mounting Medium with DAPI		 92102 30 reactions 186,000
Duolink®  In Situ Mouse/Goat Orange Starter Kit
キット内容：PLA® probe anti‐Goat MINUS(5ｘ), PLA® probe anti‐Mouse PLUS(5ｘ),Duolink®  In Situ Detection Reagents Orange,Duolink®  In Situ Wash Buffers for Fluorescence,Duolink®  In Situ Mounting Medium with DAPI		 92104 30 reactions 186,000
Duolink®  In Situ Goat/Rabbit Orange Starter Kit
キット内容：PLA® probe anti‐Rabbit MINUS(5ｘ), PLA® probe anti‐Goat PLUS(5ｘ),Duolink®  In Situ Detection Reagents Orange,Duolink®  In Situ Wash Buffers for Fluorescence,Duolink®  In Situ Mounting Medium with DAPI		 92106 30 reactions 186,000
■PLA® probe anti-X MINUS
Duolink®  In Situ PLA® probe anti-Mouse MINUS 92004-0030 30 reactions 49,000
92004-0100 100 reactions 86,000
92004-0500 500 reactions ご照会
92004-1000 1000 reactions ご照会
Duolink®  In Situ PLA® probe anti-Rabbit MINUS 92005-0030 30 reactions 49,000
92005-0100 100 reactions 86,000
92005-0500 500 reactions ご照会
92005-1000 1000 reactions ご照会
Duolink®  In Situ PLA® probe anti-Goat MINUS 92006-0030 30 reactions 49,000
92006-0100 100 reactions 86,000
92006-0500 500 reactions ご照会
92006-1000 1000 reactions ご照会
■PLA® probe anti-X PLUS
Duolink®  In Situ PLA® probe anti-Mouse PLUS 92001-0030 30 reactions 49,000
92001-0100 100 reactions 86,000
92001-0500 500 reactions ご照会
92001-1000 1000 reactions ご照会
Duolink®  In Situ PLA® probe anti-Rabbit PLUS 92002-0030 30 reactions 49,000
92002-0100 100 reactions 86,000
92002-0500 500 reactions ご照会
92002-1000 1000 reactions ご照会
Duolink®  In Situ PLA® probe anti-Goat PLUS 92003-0030 30 reactions 49,000
92003-0100 100 reactions 86,000
92003-0500 500 reactions ご照会
92003-1000 1000 reactions ご照会
■Detection Reagents
Duolink®  In Situ Detection Reagents Green 92014-0030 30 reactions 72,000
92014-0100 100 reactions 128,000
92014-0500 500 reactions ご照会
92014-1000 1000 reactions ご照会
Duolink®  In Situ Detection Reagents Orange 92007-0030 30 reactions 65,000
92007-0100 100 reactions 115,000
92007-0500 500 reactions ご照会
92007-1000 1000 reactions ご照会
Duolink®  In Situ Detection Reagents Red 92008-0030 30 reactions 65,000
92008-0100 100 reactions 115,000
92008-0500 500 reactions ご照会
92008-1000 1000 reactions ご照会
Duolink®  In Situ Detection Reagents Far Red 92013-0030 30 reactions 72,000
92013-0100 100 reactions 128,000
92013-0500 500 reactions ご照会
92013-1000 1000 reactions ご照会
Duolink®  In Situ Detection Reagents Brightfield　　　　　　　　 92012-0030 30 reactions 105,000
92012-0100 100 reactions 155,000
92012-0500 500 reactions ご照会
92012-1000 1000 reactions ご照会
■関連製品
Duolink®  In Situ Probemaker MINUS*1 92010-0020 1 kit 86,000
92010-0020-10 10 kit ご照会
Duolink®  In Situ Probemaker PLUS*1 92009-0020 1 kit 86,000
92009-0020-10 10 kit ご照会
Duolink®  In Situ Mounting Medium with DAPI 82040-0005 5 ml 40,000
Duolink®  In Situ Brightfield Mounting Medium 80102-0040 40 ml 9,000
Duolink®  In Situ Nuclear Stain, Anti-Fade  82064-0001  1 ml 15,000 
Duolink®  In Situ Wash Buffers for Fluorescence*2 82049-0004 4 L 11,000
Duolink®  In Situ Wash Buffers for Brightfield*2 82047-0004 4 L 11,000
Duolink®  In Situ Control Kit 92011-0001 1 kit 97,000
Duolink® ImageTool 90806-0001 1 each 180,000
Duolink®  In Situ Heat Transfer Block 82065-0001 1 block 53,000

*1:各Probemakerは20μgの抗体を標識することができます。
*2#82049-0004はWash Buffer Aが3袋(3L)とWash Buffer Bが1袋（1L）で、#82047-0004はWash Buffer Aが4袋（4L）でそれぞれ構成されています。大容量サイズもご用意しております。詳しくは弊社営業所または販売取扱店までお問い合わせください。

※掲載の内容は、'12年4月現在の情報に基づいております。

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