( )*の中の数値は規格値ではなく、参考としての物性値です。

移動相とする緩衝液中にイオンペア試薬を溶解して使用します。イオンペア試薬を使用して分析を行う際は、分析前の平衡時間や分析終了後のカラム洗浄時間を長めにしてください。これはイオンペア試薬自体が充填剤に保持されるので平衡や洗浄に時間がかかるためです。炭素鎖長が C₁₀ 以下のイオンペア試薬を使用する場合、目安としては分析前の平衡は 20 分、分析後の洗浄は 5％ アセトニトリルなどで 30 分程度必要です。（C₁₀ 以上のイオンペア試薬を使用する場合、カラム内のイオンペア試薬の洗浄に 1 時間以上かかることもありますので、専用のカラムを用意していただくことをお薦めします）

以下の方法は弊社、推奨の設定方法です。

※HILIC カラムについてはこちら

イオンペア試薬の条件設定

Dabsyl Chloride(4-Dimethylaminoazobenzene-4'-sulfonyl Chloride)

C₁₄H₁₄ClN₃O₂S
M.W.=323.80

本製品は暗赤色結晶、m.p.185 ～ 188℃ (dec.)、水にはほとんど溶けない。アセトンにわずかに溶ける。
アミノ基のラベル化剤で、アミン、アミノ酸、ペプチドなどと結合し、可視部に強い吸収（最大吸収波長 430 nm）をもつ Dabsyl 誘導体を生成する。
DNBC（3,5-Dinitrobenzoyl Chloride）に比べ約 100 倍、蛍光ラベル化剤であるダンシルクロリドと同程度の感度を有するラベル化剤です。

例）

1. アミノ酸のラベル化
   アミノ酸 60 nmol を 0.3 mL の炭酸ナトリウム－炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH 8.9、0.1 mol/L）に溶かし、本製品の 10 µmol/mL アセトン溶液 0.3 mL を加え、 攪拌しながら 70℃で 6 分反応させる。
2. ペプチドのラベル化
   サンプル 300 nmol を 0.5 mL の炭酸ナトリウム－炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH 8.9）に溶かし、本製品の 10 µmol/mL アセトン溶液 0.5 mL を加え、70℃で 6 分反応させる。反応液を減圧乾固し、5.7N-塩酸 1.5 mL を加え、105℃で 3 時間加水分解し、HPLC のサンプルにする。

Ref.

1. J.K.Lin,J.Y.Chang,Anal.Chem.47,1634(1975).
2. J.Y.Chang,E.H.Creaser,J.Chromatogr.116,215(1976).
3. J.K.Lin,C.C.Lai,Anal.Chem.52,630(1980).

3,5-Dinitrobenzoyl Chloride（DNBC）

本製品は淡黄色結晶、m.p.67 ～ 69℃、アルコール、エーテル、ベンゼンに溶ける。水酸基（R-OH）、アミノ基（R-NH₂、R-NH-R'）とも反応し、水酸基では 3,5-ジニトロベンゾイルエステル、アミノ基では 3,5-ジニトロンベンズアミドを生成する。

C₇H₃ClN₂O₅
M.W.=230.56

例）

サンプル数 mg をテトラヒドロフラン 5 mL に溶かし、本製品 40 mg、ピリジン 2 ～ 3 滴加えて密封し、60℃で 1 時間反応させて室温に冷却後、反応液を HPLC のサンプルにする。
塩酸を除くためにピリジン、またはトリエチルアミンを使用した場合、分析する前処理としてクリーンアップする必要がある。
クリーンアップ法；溶媒を除去してエーテル抽出を行い、エーテル層を希塩酸と水で洗浄する。

Ref.

1. T.H.Jupile,Am.Lab.8,85(1976).
2. M.A.Carey,H.E.Persinger,J.Chromatogr.Sci. 10,573(1972).
3. 鈴木義仁, 土屋典子, 分析化学 30,240(1981).
4. L.J.Elrod,L.B.White,S.G.Spanton,D.G.Stroz,P.J.Cugier,L.A.Luka,Anal.Chem. 56,1786(1984).

NBD Chloride(7-Chloro-4-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole)

本製品は淡黄色結晶、m.p.95 ～ 98℃、アルコールに可溶、ダンシルクロリドより水に溶ける。
アミノ基（R-NH₂、R-NH-R'）と反応して強い蛍光を発する。また、加水分解によって得られたアミノ基（カルバミド系農薬）やメルカプト基（R-SH）ともよく反応する。

C₆H₂ClN₃O₃
M.W.=199.55

例）

1 ～ 20 µg のアミンを含むメタノール溶液 25 ～ 500 µL に 4 ～ 8 倍モル過剰の本製品 0.05％ メタノール溶液を加え、0.1 M-炭酸水素ナトリウム 50 ～ 100 µLを加えて攪拌し、55℃ で 1 ～ 5 時間反応させ、室温と冷却後、反応液を HPLC のサンプルにする。

Ref.

1. J.F.Lawrence,R.W.Frei,Anal.Chem.,44,2046(1972)
2. H.F.Van,A.Heyndrickx,Anal.Chem.,46,286(1974)
3. H.J.Klimisch,L.Stadlen,J.Chromatogr.,90,141(1974)
4. J.H.Wolfram,J.Chromatogr.,132,37(1977)
5. Y.Nishikawa,K.Kuwata,Anal.Chem.,57,1864(1985)

o-Phthalaldehyde,recryst（OPA）

本製品は黄色結晶、m.p.56 ～ 57℃。水、多くの有機溶媒に可溶、エーテルに難溶。1 級アミン、チオール化合物と反応して蛍光を発する。

分析条件
カラム	COSMOSIL 5C18-MS-II 4.6 mm I.D. × 150 mm
移動相	Methanol / 20 mmol/L Phosphoric Acid ＝ 70 / 30
流　速	1.0 mL/min
温　度	30℃
検　出	Ex.340 nm Em.450 nm, RANGE 128
サンプル	OPA-Glycine OPA-L-Alanine OPA-L-Valine OPA-L-Leucine

C₆H₄(CHO)₂
M.W.=134.13

例）

サンプル 5 mL に 10％ 塩酸 0.05 mL 加えて酸性とした後、本製品の 4 mg/mL メタノール溶液 2 mL を加えて攪拌し、2-メルカプトエタノール 0.05 mL と pH 9 炭酸緩衝液 3 mL を加え、1 分室温に放置してからフィルターでろ過し、HPLC のサンプルにする。

L-FDVDA (1-Fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-valine-N,N-dimethylethylenediamine-amide)

本製品は黄色 ～ 黄赤色の結晶または粉末、アセトンに溶けます。アミノ基のラベル化剤で、その構造中に不斉炭素を含むため、ラベル化したアミノ酸を C₁₈ などのアキラルカラムで光学分離することができます（図1）。また、既存の光学分離用ラベル化剤よりもイオン化しやすい構造のため、MS（質量分析計）での高感度検出が可能であり（図2）、微量ペプチドの構造解析に適しています。

図 1 : L-FDVDA でラベル化した DL-アミノ酸の光学分離

図 2 :ラベル化剤の違いによる、LC-MS での感度の比較

データご提供:京都大学大学院 薬学研究科 医薬創成情報科学専攻 システムケモセラピー 制御分子学分野　倉永 健史 特任講師

ペプチドの構造解析など、本試薬の使用方法は下記の参考文献をご参照ください。

1. Kuranaga, T.; Minote, M.; Morimoto, R.; Pan, C.; Ogawa, H.; Kakeya, H. ACS Chem. Biol. 2020, 15, p. 2499.
2. Pan, C.; Kuranaga, T.; Cao, X.; Suzuki, T.; Dohmae, N.; Shinzato, N.; Onaka, H.; Kakeya H. J. Org. Chem. 2021, 86, p. 1843.
3. Morimoto, R.; Matsumoto, T.; Minote, M.; Yanagisawa, M.; Yamada, R.; Kuranaga, T.; Kakeya, H. Chem. Pharm. Bull. 2021, 69, p. 265
4. Jiang, Y.; Matsumoto, T.; Kuranaga, T.; Lu, S.; Wang, W.; Onaka, H.; Kakeya, H. J. Antibiot. 2021, 74, p. 307.
5. Pan, C.; Kuranaga, T.; Kakeya, H. J. Nat. Med. 2021, 75, p. 339.

キットの構成（100 回測定用）（ユーザー準備品も含む）

	名称	キット容量	添加量 / 回	ラベル化剤
①	サンプル溶液*1	ユーザー準備品	100 µL
②	ラベル化剤溶液*2	10 mL	100 µL
③	反応開始液	10 mL	100 µL
④	脱ラベル化液（側鎖用）*3	10 mL	100 µL
⑤	反応停止液	10 mL	100 µL
⑥	メタノールやアセトニトリルなど	ユーザー準備品	500 µL or 600 µL

^*1 反応する官能基の総 mol 量は 1.0 µmol 以下にしてください。濃い場合には、サンプルを希釈するか添加量を減らしてください。
^*2 本液には、ラベル化剤 (D)FDLDA を採用しています。
^*3 本液には、6-Mercapto-1-hexanol [M.W.: 134.24(C₆H₁₄OS)]を含みます。

他ラベル化剤との比較

アキラルカラムによるアミノ酸の光学分離では、Marfey 法による N^α-(5-Fluoro-2,4-dinitrophenyl)-L-alaninamide [(L)FDAA] や N^α-(5-Fluoro-2,4-dinitrophenyl)-L-leucinamide [(L)FDLA] などのラベル化剤が知られていますが、本製品のラベル化剤である (D)FDLDA は下図の赤丸で囲んだ構造がイオン化しやすいため、UV での感度は既存品と同等ですが、MS での感度は高まります（下図赤枠）。なお、本製品では D 体のラベル化剤を使用しているため溶出順が逆になります。

各アミノ酸の DL 体の分離（ラベル化法 2）

各分子量のアミノ酸ごとに選択的に検出することができました。

濃度の異なるアミノ酸水溶液を本製品によりラベル化し HPLC で分析したところ、直線的な検量線が作成できました。

スポーツ飲料（HPLC・ラベル化法 2）

MEM 非必須アミノ酸溶液（#06344）（LC/MS・ラベル化法 1）

回復系アミノ酸飲料（HPLC・ラベル化法 2）

ヒスタミン（HPLC・ラベル化法 1）

アミノ酸以外のアミン化合物やチオール化合物にも適用可能です。