HPLC(高速液体クロマトグラフィー)用関連試薬

    HPLC 用溶媒

    HPLC は『優れた分離能』『高検出感度』『短時間分析』『簡単操作』などの長所を生かし、臨床・医学の分野から天然物の精製・分取、さらには公害分析・食品分析まで現在の機器分析の主流となっています。
    弊社では検出器などの高感度化に対応した厳しい規格を設定し、これらの規格を保証した高純度の各種 HPLC 用溶媒を用意しています。

    規格

    製品名Assay
    (GC)
    (%)
    Density
    (20℃)
    (g/mL)
    Specific Gravity
    (20/
    20℃)
    Refractive
    Index n20D
    AbsorbanceMaximum
    Impurities
    Acetone min.99.7 0.789 〜
    0.792
    1.358 〜 1.360 330 nm max. 1.00
    335 nm max. 0.30
    340 nm max. 0.10
    345 nm max. 0.05
    350〜400 nm max. 0.01
    • Solubility in water:passes test
    • Water:0.3%
    • Nonvolatile residue:5 ppm
    • Peroxide (as H2O2):0.002%
    Acetonitrile min.99.8 (0.780 〜 0.784)* 0.782 〜
    0.785
    1.343 〜 1.346 200 nm max. 0.05
    220 nm max. 0.02
    225〜400 nm max. 0.01
    • Water:0.05%
    • Acid (as CH3COOH):0.001%
    • Nonvolatile residue:0.001%
    • Peroxide (as H2O2):0.0005%
    • Allyl alcohol:0.01%
    • Hydrogen Cyanide:0.0005%
    • Ammonium (NH4):0.00003%
    • Fluorescence test:passes test
    • Substances reducing permanganate
      :passes test
    Benzene min.99.7 0.876 〜
    0.880
    1.499 〜 1.502 280 nm max 1.00
    290 nm max. 0.20
    300 nm max. 0.10
    320 nm max. 0.05
    340〜400 nm max. 0.01
    • Water:0.03%
    • Nonvolatile residue:0.001%
    • Peroxide (as H2O2):0.001%

    t-Butyl Methyl

    Ether
    (MTBE)

    min.99.5 0.738 〜
    0.742
    1.368 〜 1.371 220 nm max. 1.00
    250 nm max. 0.15
    280 nm max. 0.01
    • Water:0.1%
    • Nonvolatile residue:0.005%
    • Peroxide (as H2O2):passes test
    Chloroform min.99.0 (1.474 〜 1.491)* 1.477 〜
    1.494
    1.444 〜 1.446 254 nm max. 0.30
    260 nm max. 0.10
    280 nm max. 0.02
    300〜400 nm max. 0.01
    • Water:0.05%
    • Nonvolatile residue:0.001%
    • Chloride (Cl):0.0001%
    Cyclohexane min.99.7 0.777 〜
    0.779
    1.425 〜 1.427 210 nm max. 1.00
    220 nm max. 0.50
    230 nm max. 0.20
    240 nm max. 0.05
    250〜400 nm max. 0.01
    • Water:0.01%
    • Nonvolatile residue:0.001%
    • Peroxide (as H2O2):0.002%
    o-Dichloro-
    benzene
    min.99.0 (1.303 〜 1.308)* 1.305 〜
    1.310
    1.550 〜 1.553 300 nm max. 0.30
    310 nm max. 0.15
    350 nm max. 0.10
    360〜400 nm max. 0.05
    • Water:0.05%
    • Nonvolatile residue:0.001%
    1,2-Dichloro-
    ethane
    min.99.7 1.251 〜
    1.261
    1.442 〜 1.446 230 nm max. 0.70
    240 nm max. 0.30
    250 nm max. 0.10
    260 nm max. 0.05
    270〜400 nm max. 0.01
    • Water:0.03%
    • Nonvolatile residue:0.001%
    • Peroxide (as H2O2):0.001%
    Dichloro-
    methane
    min.99.5 (1.322)* 235 nm max. 0.70
    240 nm max. 0.30
    254 nm max. 0.02
    270〜400 nm max. 0.01
    • Water:0.02%
    • Nonvolatile residue:0.001%
    • Acid(as HCl):0.01%
    • Free chlorine (Cl):passes test
    N,N-Dimethyl-
    formamide
    min.99.7 0.947 〜
    0.952
    1.428 〜 1.432 270 nm max. 1.00
    290 nm max. 0.10
    310 nm max. 0.05
    330〜400 nm max. 0.01
    • Water:0.1%
    • Nonvolatile residue:0.005%
    • Peroxide (as H2O2):0.001%
    • Acid (as HCOOH):0.003%
    1,4-Dioxane min.99.0 (1.030 〜 1.037)* 1.032 〜
    1.039
    1.421 〜 1.423 240 nm max. 1.00
    254 nm max. 0.35
    280 nm max. 0.10
    300〜400 nm max. 0.01
    • Water:0.2%
    • Nonvolatile residue:0.005%
    • Peroxide (as H2O2):0.01%
    Distilled Water 1.332 〜 1.334 210 nm max. 0.02
    230〜400 nm max. 0.01
    • Nonvolatile residue:0.001%
    • Fluorescence test:passes test
    • Substances reducing permanganate :passes test
    Ethanol
    (99.5)
    min.99.5 0.789 〜
    0.791
    1.360 〜 1.363 210 nm max. 0.70
    220 nm max. 0.40
    230 nm max. 0.20
    254 nm max. 0.03
    280 〜400 nm max. 0.01
    • Water:0.3%
    • Nonvolatile residue:5 ppm
    • Peroxide (as H2O2):0.001%
    Ethyl Acetate min.99.8 0.898 〜
    0.902
    1.371 〜 1.374 254 nm max. 1.00
    260 nm max. 0.20
    270 nm max. 0.10
    280 nm max. 0.02
    290〜400 nm max. 0.01
    • Water:0.1%
    • Nonvolatile residue:0.002%
    • Acid (as CH3COOH):0.003%
    • Peroxide (as H2O2):0.001%
    • Fluorescence test:passes test
    Heptane min.99.0 (0.680 〜 0.686)* 0.681 〜
    0.687
    1.386 〜 1.389 210 nm max. 0.70
    220 nm max. 0.30
    230 nm max. 0.10
    240 nm max. 0.05
    254 〜400 nm max. 0.01
    • Water:0.05%
    • Nonvolatile residue:0.001%
    • Peroxide (as H2O2):0.001%
    1,1,1,3,3,3-
    Hexafluoro-
    2-propanol
    min.99.5 (1.616 〜 1.620)* 1.619 〜
    1.623
    200 nm max. 0.05
    220 nm max. 0.03
    240 nm max. 0.02
    • Water:0.05%
    • Nonvolatile residue:0.01%
    Hexane min.96.0 (0.658 〜 0.662)* 0.659 〜
    0.663
    1.374 〜 1.377 210 nm max. 0.30
    220 nm max. 0.15
    230 nm max. 0.05
    240 nm max. 0.03
    254 〜400 nm max. 0.01
    • Water:0.01%
    • Nonvolatile residue:0.0005%
    • Acid (as CH3COOH):0.001%
    • Peroxide (as H2O2):0.0005%
    • Fluorescence test:passes test
    Methanol min.99.8 (0.792)* 1.327 〜 1.330 210 nm max. 0.70
    220 nm max. 0.30
    230 nm max. 0.15
    240 nm max. 0.07
    254 nm max. 0.02
    270〜400 nm max. 0.01
    • Water:0.05%
    • Nonvolatile residue:5 ppm
    • Peroxide (as H2O2):5 ppm
    • Fluorescence test:passes test
    1-Propanol min.99.5 0.801 〜
    0.806
    1.383 〜 1.387 230 nm max. 0.30
    240 nm max. 0.15
    254 nm max. 0.03
    270〜400 nm max. 0.01
    • Water:0.2%
    • Nonvolatile residue:0.001%
    • Peroxide (as H2O2):5 ppm
    2-Propanol min.99.7 0.784 〜
    0.787
    1.376 〜 1.379 210 nm max. 0.70
    220 nm max. 0.30
    230 nm max. 0.20
    254 nm max. 0.05
    260〜400 nm max. 0.01
    • Water:0.1%
    • Nonvolatile residue:0.001%
    • Peroxide (as H2O2):0.001%
    Tetrahydrofuran min.99.7 0.884 〜
    0.889
    1.406 〜 1.409 254 nm max. 0.30
    280 nm max. 0.10
    313 nm max. 0.05
    340〜400 nm max. 0.01
    • Water:0.05%
    • Nonvolatile residue:0.001%
    • Peroxide (as H2O2):0.03%
    Toluene min.99.8 0.864 〜 0.868 1.496 〜 1.498 285 nm max. 1.00
    290 nm max. 0.50
    300 nm max. 0.20
    310 nm max. 0.05
    320 nm max. 0.03
    350〜400 nm max. 0.01
    • Water:0.03%
    • Nonvolatile residue:0.001%
    • Peroxide (as H2O2):0.001%

    ( )*の中の数値は規格値ではなく、参考としての物性値です。

    価格表

    製品名法規規格製品番号容量オンライン
    カタログへ
    Acetone 危 4-1 水 SP 00325-31 1 L e-Nacalai.jpg
    Acetonitrile 劇、危 4-1 水 SP 00430-25 500 mL e-Nacalai.jpg
    00430-41 1 L
    00430-83 3 L
    Benzene 危 4-1 SP 04028-11 1 L e-Nacalai.jpg
    t-Butyl Methyl Ether 危 4-1 SP 06332-64 200 mL e-Nacalai.jpg
    06332-51 1 L
    Chloroform SP 08426-71 1 L e-Nacalai.jpg
    08426-13 3 L
    Cyclohexane 危 4-1 SP 10034-31 1 L e-Nacalai.jpg
    o-Dichlorobenzene 危 4-3 SP 11635-31 1 L e-Nacalai.jpg
    1,2-Dichloroethane 危 4-1 SP 15223-01 1 L e-Nacalai.jpg
    Dichloromethane SP 22423-61 1 L e-Nacalai.jpg
    N,N-Dimethylformamide 危 4-2 水 SP 13024-71 1 L e-Nacalai.jpg
    1,4-Dioxane 危 4-1 水 SP 13631-11 1 L e-Nacalai.jpg
    Distilled Water SP 14029-91 1 L e-Nacalai.jpg
    14029-33 3 L
    Ethanol(99.5) 危 4-アル水 SP 14741-25 500 mL e-Nacalai.jpg
    14741-41 1 L
    14741-83 3 L
    Ethyl Acetate 劇、危 4-1 SP 14746-91 1 L e-Nacalai.jpg
    14746-33 3 L
    Heptane 危 4-1 SP 17623-01 1 L e-Nacalai.jpg
    1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol SP 17814-14 100 g e-Nacalai.jpg
    17814-85 500 g
    Hexane 危 4-1 SP 17929-11 1 L e-Nacalai.jpg
    17929-53 3 L
    Methanol 劇、危 4-アル水 SP 21929-81 1 L e-Nacalai.jpg
    21929-23 3 L
    1-Propanol 危 4-アル水 SP 29033-61 1 L e-Nacalai.jpg
    2-Propanol 危 4-アル水 SP 29128-31 1 L e-Nacalai.jpg
    29128-73 3 L
    Tetrahydrofuran 危 4-1 水 SP 33125-31 1 L e-Nacalai.jpg
    33125-73 3 L
    Toluene 劇、危 4-1 SP 34130-21 1 L e-Nacalai.jpg
    34130-63 3 L

    HPLC 用プレミックス溶離液・HPLC 用プレミックス調製液・HPLC 移動相調製用添加剤

    価格表

    製品名法規規格製品番号容量オンライン
    カタログへ
    HPLC 用プレミックス溶離液
    0.1vol% Formic Acid-Acetonitrile 劇、危 4-1 水 SP 12578-61 1 L e-Nacalai.jpg
    12578-03 3 L
    0.1vol% Formic Acid-Distilled Water SP 12582-91 1 L e-Nacalai.jpg
    12582-33 3 L
    HPLC 用プレミックス調製液
    1mol/l‐Ammonium Acetate Solution SP 12236-44 100 mL e-Nacalai.jpg
    1mol/l‐Ammonium Formate Solution SP 12235-54 100 mL e-Nacalai.jpg
    りん酸緩衝液
    濃度:100 mmol/L(原液)COSMOSIL Application 対応、20 mmol/L の濃度で分析するために最適化されています。
    Phosphate Buffer Solution(pH 2.5)(5x) SP 08969-71 1 L e-Nacalai.jpg
    Phosphate Buffer Solution(pH 7.0)(5x) SP 08968-81 1 L e-Nacalai.jpg
    HPLC 移動相調製用添加剤
    Acetic Acid 危 4-2 水 SP 08963-02 25 mL e-Nacalai.jpg
    Formic Acid 劇、危 4-2 水 SP 08965-82 25 mL e-Nacalai.jpg
    Phosphoric Acid, Ortho SP 08964-92 25 mL e-Nacalai.jpg
    Trifluoroacetic Acid SP 34840-21 5 X 1 mL e-Nacalai.jpg
    34840-76 5 X 1.5 mL
    34840-34 10 mL

    劇 :劇物 
    危 4-1 :危険物第 4 類第 1 石油類
    危 4-2 :危険物第 4 類第 2 石油類
    危 4-3 :危険物第 4 類第 3 石油類
    危 4-アル :危険物第 4 類アルコール類
    水 :水溶性液体

    HPLC 用イオンペア試薬

    イオンペア試薬は、逆相クロマトグラフィーにおいて、有機溶媒と緩衝液だけでは保持時間が短くなる、親水性の高い化合物を分析するための試薬です。弊社では医薬品や生体内物質の分析にも安心してご使用いただける製品を用意しています。

    使用方法

    移動相とする緩衝液中にイオンペア試薬を溶解して使用します。イオンペア試薬を使用して分析を行う際は、分析前の平衡時間や分析終了後のカラム洗浄時間を長めにしてください。これはイオンペア試薬自体が充填剤に保持されるので平衡や洗浄に時間がかかるためです。炭素鎖長が C10 以下のイオンペア試薬を使用する場合、目安としては分析前の平衡は 20 分、分析後の洗浄は 5% アセトニトリルなどで 30 分程度必要です。(C10 以上のイオンペア試薬を使用する場合、カラム内のイオンペア試薬の洗浄に 1 時間以上かかることもありますので、専用のカラムを用意していただくことをお薦めします)

    条件設定方法

    以下の方法は弊社、推奨の設定方法です。
    ionpea-jyoukensettei.png

    ※HILIC カラムについてはこちら

    イオンペア試薬の条件設定

    2012-p96-2.png

    分析条件
    カラム COSMOSIL 5C18-PAQ 検 出

    UV 270 nm

    カラムサイズ 4.6 mm I.D. × 150 mm サンプル

    1.L-Noradrenaline

    2.L-Adrenaline

    3.L-DOPA

    4.Dopamine

    移動相 **
    流 速 1.0 mL/min
    温 度 30℃

    分析例

    低分子不飽和カルボン酸

    AP-0433.png

    分析条件
    カラム COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ
    4.6 mm I.D. × 150 mm
    移動相

    Acetonitrile / 5 mmol/L Tetra-n-butylammonium Phosphate,

    20 mmol/L Phosphate Buffer(pH 7) = 10 / 90

    流 速 1.0 mL/min
    温 度 30℃
    検 出 UV 230 nm, 0.5 AUFS
    サンプル
    1. Acrylic Acid (2.0 µg)
    2. Crotonic Acid (2.0 µg)
    3. Tiglic Acid (2.0 µg)
    4. Sorbic Acid (2.0 µg)

    アミノ酸

    AP-0437.png

    分析条件
    カラム COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ
    4.6 mm I.D. × 150 mm
    移動相 Acetonitrile / 5 mmol/L Sodium 1-Hexanesulfonate, 20 mmol/L Phosphate Buffer(pH 3) = 10 / 90
    流 速 1.0 mL/min
    温 度 30℃
    検 出 UV 215 nm, 0.5 AUFS
    サンプル
    1. L-Histidine (1.0 µg)
    2. L-Tyrosine (3.0 µg)
    3. L-(-)Phenylalanine (1.0 µg)
    4. L-Tryptophan (0.5 µg)

    価格表

    塩基性物質用

    製品名分子式規格製品番号容量オンライン
    カタログへ
    Sodium 1‐Butanesulfonate
    1‐ブタンスルホン酸ナトリウム
    CH3(CH2)3SO3Na SP 31331-94 5 g e-Nacalai.jpg
    Sodium 1‐Butanesulfonate
    1‐ブタンスルホン酸ナトリウム(0.5M水溶液)
    CH3(CH2)3SO3Na SP 31332-84 5 X 10 mL e-Nacalai.jpg
    Sodium 1‐Pentanesulfonate
    1‐ペンタンスルホン酸ナトリウム
    CH3(CH2)4SO3Na SP 31730-64 5 g e-Nacalai.jpg
    31730-22 25 g
    Sodium 1‐Hexanesulfonate
    1‐ヘキサンスルホン酸ナトリウム
    CH3(CH2)5SO3Na SP 31529-24 5 g e-Nacalai.jpg
    31529-82 25 g
    Sodium 1‐Heptanesulfonate
    ‐ヘプタンスルホン酸ナトリウム
    CH3(CH2)6SO3Na SP 31528-34 5 g e-Nacalai.jpg
    31528-92 25 g
    Sodium 1‐Octanesulfonate
    ‐オクタンスルホン酸ナトリウム
    CH3(CH2)7SO3Na SP 31729-04 5 g e-Nacalai.jpg
    31729-62 25 g
    Sodium 1‐Octanesulfonate
    ‐オクタンスルホン酸ナトリウム
    (0.5M水溶液)
    CH3(CH2)7SO3Na SP 31733-76 5 X 10 mL e-Nacalai.jpg
    Sodium 1‐Nonanesulfonate
    1‐ノナンスルホン酸ナトリウム
    CH3(CH2)8SO3Na SP 31626-44 5 g e-Nacalai.jpg
    Sodium 1‐Decanesulfonate
    1‐デカンスルホン酸ナトリウム
    CH3(CH2)9SO3Na SP 31429-34 5 g e-Nacalai.jpg
    31429-92 25 g
    Sodium 1‐Dodecanesulfonate
    1‐ドデカンスルホン酸ナトリウム
    CH3(CH2)11SO3Na SP 31426-64 5 g e-Nacalai.jpg
    Sodium Lauryl Sulfate
    ラウリル硫酸ナトリウム
    CH3(CH2)11OSO3Na SP 31623-32 25 g e-Nacalai.jpg
    31623-45 500 g

    酸性物質用

    製品名分子式規格貯法製品番号容 量オンライン
    カタログへ
    Tetra‐n‐butylammonium Bromide
    臭化テトラ‐n‐ブチルアンモニウム
    (C4H9)4NBr SP 冷蔵 32824-72 25 g e-Nacalai.jpg
    Tetra‐n‐butylammonium Chloride
    塩化テトラ‐n‐ブチルアンモニウム
    (C4H9)4NCl EP 冷蔵 32935-64 5 g e-Nacalai.jpg
    32935-22 25 g
    Tetra‐n‐butylammonium Hydrogensulfate
    硫酸水素テトラ‐n‐ブチルアンモニウム
    (C4H9)4N・HSO4 GR 室温 32924-62 25 g e-Nacalai.jpg
    Tetra‐n‐butylammonium Iodide
    よう化テトラ‐n‐ブチルアンモニウム
    (C4H9)4NI SP 冷蔵 32905-12 25 g e-Nacalai.jpg
    Tetra‐n‐butylammonium Perchlorate
    過塩素酸テトラ‐n‐ブチルアンモニウム
    (C4H9)4NClO4 SP 冷蔵 32906-44 5 g e-Nacalai.jpg
    32906-02 25 g
    Tetra‐n‐butylammonium Phosphate
    りん酸テトラ‐n‐ブチルアンモニウム
    (C4H9)4N(H2PO4) SP 冷蔵 32929-54 5 g e-Nacalai.jpg
    Tetra‐n‐butylammonium Phosphate
    りん酸テトラ‐n‐ブチルアンモニウム
    (0.5M水溶液)
    (C4H9)4N(H2PO4) SP 室温 32926-26 10 mL e-Nacalai.jpg
    32926-84 5 X 10 mL

    DL-アミノ酸ラベル化キット

    本製品はアミノ酸を HPLC 分析の前にラベル化するためのキットです。アミノ酸は親水性が高く UV 吸収が小さいため、ラベル化してから HPLC 分析することが多用されています。また、近年、D 体のアミノ酸が注目されていますが、イソチオシアン酸フェニルやダンシルクロリドなどの汎用的なラベル化剤では、D 体と L 体とを分離するには高価なキラルカラムが必要です。
    本製品を使用すると煩雑なラベル化を簡単に行えるだけではなく、不斉炭素を含有するラベル化剤 (D)FDLDA を採用しているため、ラベル化したアミノ酸を C18 などのアキラルカラムで光学分離することができます。

    特長

    • 誰でも簡単にアミノ酸が分析可能
    • キラルカラムを使わずにアミノ酸の光学異性体を分離
    • MS(質量分析計)での高感度検出

    HPLC 分析例

    各アミノ酸の DL 体の分離(ラベル化法 1)

    グリシンを除く 19 種類のアミノ酸の D 体と L 体とを分離することができました。

    p1-HPLC.png

    分析条件
    カラム COSMOSIL 5C18-AR-II 
    4.6 mm I.D. × 150 mm
    流 速 1.0 mL/min
    移動相 A: 0.1 % Formic Acid - 20 % Acetonitrile
    B: 0.1 % Formic Acid - 50 % Acetonitrile
    B conc. 0 → 100% 20 min 直線グラジエント
    温 度 30℃
    検 出 UV 340 nm
    サンプル (DL)Amino Acid-(D)DLDA derivatives

    キット構成

    キットの構成(100 回測定用)(ユーザー準備品も含む)

    名称キット容量添加量 / 回ラベル化剤
    サンプル溶液*1 ユーザー準備品 100 µL p2-FDLDA.png
    ラベル化剤溶液*2 10 mL 100 µL
    反応開始液 10 mL 100 µL
    脱ラベル化液(側鎖用)*3 10 mL 100 µL
    反応停止液 10 mL 100 µL
    メタノールやアセトニトリルなど ユーザー準備品 500 µL or 600 µL
    *1 反応する官能基の総 mol 量は 1.0 µmol 以下にしてください。濃い場合には、サンプルを希釈するか添加量を減らしてください。
    *2 本液には、ラベル化剤 (D)FDLDA を採用しています。
    *3 本液には、6-Mercapto-1-hexanol [M.W.: 134.24(C6H14OS)]を含みます。

    ラベル化法

    2 種類のラベル化法

    本製品に採用されているラベル化剤 (D)FDLDA はアミノ基と反応します。また、チロシンのフェノール性水酸基やシステインのチオール基などの一部側鎖もラベル化されます。ラベル化法 1 の操作 2 でアミノ酸の側鎖(Lys を除く)のラベル化剤を除去することができます。

    p2-raberukahannou_hyou.png

    表 1 HPLC で検出されるラベル化剤由来のピーク

    名称分子量説明
    (D)FDLDA 385.39 (C16H24FN5O5) 未反応のラベル化剤(ラベル化法 2 のみ)
    (D)FDLDA(Hydrolysed) 383.40 (C16H25N5O6) ラベル化剤の加水分解物
    (D)DLDA-S-C6H12OH 499.63 (C22H37N5O6S) ラベル化剤と脱ラベル化剤(側鎖用)の反応物(ラベル化法 1 のみ)
    実際のサンプルを分析する前にブランク分析を行われることを強く推奨します。

    参考文献

    Kuranaga, T.; Minote, M.; Morimoto, R.; Pan, C.; Ogawa, H.; Kakeya, H. Highly Sensitive Labeling Reagents for Scarce Natural Products. ACS Chem. Biol. 2020, 15(9), p. 2499-2506.

    LC/MS 分析例

    他ラベル化剤との比較

    アキラルカラムによるアミノ酸の光学分離では、Marfey 法による Nα-(5-Fluoro-2,4-dinitrophenyl)-L-alaninamide [(L)FDAA] や Nα-(5-Fluoro-2,4-dinitrophenyl)-L-leucinamide [(L)FDLA] などのラベル化剤が知られていますが、本製品のラベル化剤である (D)FDLDA は下図の赤丸で囲んだ構造がイオン化しやすいため、UV での感度は既存品と同等ですが、MS での感度は高まります(下図赤枠)。なお、本製品では D 体のラベル化剤を使用しているため溶出順が逆になります。

    p3-zu1.png
    分析条件
    カラム COSMOCORE 2.6C18 
    2.1 mm I.D. × 100 mm
    流 速 0.2 mL/min
    移動相 A: 0.1 % Formic Acid - 20 % Acetonitrile
    B: 0.1 % Formic Acid - 70 % Acetonitrile
    B conc. 0 → 100% 20 min 直線グラジエント
    温 度 40℃
    検 出 UV 340 nm, MS-ESI (+)
    サンプル Labeled Leucine
    1.  D form
    2.  L form

    各アミノ酸の DL 体の分離(ラベル化法 2)

    各分子量のアミノ酸ごとに選択的に検出することができました。

    p3-zu2.png
    分析条件
    カラム COSMOCORE 2.6C18 
    2.1 mm I.D. × 100 mm
    流 速 0.2 mL/min
    移動相 A: 0.1 % Formic Acid - 20 % Acetonitrile
    B: 0.1 % Formic Acid - 50 % Acetonitrile
    B conc. 0 → 100% 20 min 直線グラジエント
    温 度 40℃
    検 出 MS-ESI (+)
    サンプル (DL)Amino Acid-(D)DLDA derivatives

    定量性

    濃度の異なるアミノ酸水溶液を本製品によりラベル化し HPLC で分析したところ、直線的な検量線が作成できました。

    p4-teiryou.png

    DL-アミノ酸ラベル化キットとアキラル型ラベル化剤との比較

    下記の 3 種類のラベル化試薬を用いて、プレカラムラベル化法による比較を行いました。

    (1) #19942-74 DL-アミノ酸ラベル化キット
    (2) #10427-91 ダブシルクロリド
    (3) #27810-44 o-フタルアルデヒド

    アミノ酸の DL 分離

    ラベル化した DL-フェニルアラニンを C18 カラムで分析を行いました。DL-アミノ酸ラベル化キットは、ラベル化試薬の構造中に不斉炭素を有し、アミノ酸の D 体と L 体とがジアステレオマーの関係になるために分離することができます。


    DL-767.png
    分析条件
    カラム COSMOSIL 2.5C18-MS-II 
    2.0 mm I.D. × 50 mm
    検 出 UV(1)340 nm,(2)430 nm,(3)241 nm
    移動相 A: 0.1 % Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 20 / 80
    B: 0.1 % Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 80 / 20
    B conc. 0 → 100% 10 min 直線グラジエント
    サンプル

    Labeled DL-Phenylalanine

    サンプル濃度

    0.01 mg/mL (as DL-Phenylalanine)

    流 速 0.2 mL/min ラベル化試薬

    (1)DL-Amino Acid Labeling Kit
    (2)Dabsyl Chloride
    (3)o-Phthalaldehyde

    温 度 40℃ 注入量

    1.0 μL

    o-フタルアルデヒドでラベル化されたアミノ酸は、一般的には蛍光検出器を使用して分析します。

    質量分析計(MS)での検出感度

    ラベル化した L-フェニルアラニンの MS での感度比較を行いました。DL-アミノ酸ラベル化キットのラベル化試薬やダブシルクロリドはイオン化しやすい構造であるため、MS での検出感度が高くなりました。


    L-733.png
    分析条件
    カラム COSMOSIL 2.5C18-MS-II 
    2.0 mm I.D. × 50 mm
    検 出 ESI(+)-MS
    移動相 A: 0.1 % Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 20 / 80
    B: 0.1 % Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 80 / 20
    B conc. 0 → 100% 10 min 直線グラジエント
    サンプル

    Labeled L-Phenylalanine

    サンプル濃度

    0.01 mg/mL (as L-Phenylalanine)

    流 速 0.2 mL/min ラベル化試薬

    (1)DL-Amino Acid Labeling Kit
    (2)Dabsyl Chloride
    (3)o-Phthalaldehyde

    温 度 40℃ 注入量

    1.0 μL

    ラベル化サンプルの安定性

    ラベル化した L-フェニルアラニンを反応日から 1 日後、3 日後、7 日後に HPLC 分析を行いました。o-フタルアルデヒドでラベル化したサンプルは安定性が低いため、マニュアル操作によるラベル化には適さず、分析装置中でのオンライン分析での使用に限定した方が良いと考えられます。

    反応後
    日数
    DL-アミノ酸ラベル化キットダブシルクロリドo-フタルアルデヒド
    1 100% 100% 100%
    3 113% 95% 0%
    7 106% 96% 0%

    測定条件は「アミノ酸の DL 分離」と同じ。反応後 1 日目のピーク面積を 100% としました。サンプルは冷蔵保存。

    その他分析例

    スポーツ飲料(HPLC・ラベル化法 2)

    AP-Suport.png

    分析条件
    カラム COSMOSIL 5C18-AR-II 
    4.6 mm I.D. × 150 mm
    温 度 30℃
    移動相 A: 0.1 % Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 20 / 80
    B: 0.1 % Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 50 / 50
    B conc. 0 → 100% 20 min 直線グラジエント
    検 出 UV 340 nm
    サンプル

    Sports drink

    1. (L)Arg-(D)DLDA
    2. (L)Val-(D)DLDA
    3. (L)Ile-(D)DLDA
    4. (L)Leu-(D)DLDA
    流 速 1.0 mL/min 注入量

    2.0 μL


    MEM 非必須アミノ酸溶液(#06344)(LC/MS・ラベル化法 1)

    AP-MEM.png

    分析条件
    カラム COSMOCORE 2.6C18 
    2.1 mm I.D. × 100 mm
    温 度 40℃
    移動相 A: 0.1 % Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 20 / 80
    B: 0.1 % Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 50 / 50
    B conc. 0 → 100% 20 min 直線グラジエント
    検 出 MS-ESI (+)
    サンプル

    MEM Non-Essential Amino Acids Solution

    1. (L)Asn-(D)DLDA
    2. (L)Ser-(D)DLDA
    3. Gly-(D)DLDA
    4. (L)Asp-(D)DLDA
    5. (L)Glu-(D)DLDA
    6. (L)Ala-(D)DLDA
    7. (L)Pro-(D)DLDA
    流 速 0.2 mL/min 注入量

    2.0 μL


    回復系アミノ酸飲料(HPLC・ラベル化法 2)

    AP-kaifukukei.png

    分析条件
    カラム COSMOSIL 5C18-AR-II 
    4.6 mm I.D. × 150 mm
    温 度 30℃
    移動相 A: 0.1 % Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 20 / 80
    B: 0.1 % Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 50 / 50
    B conc. 0 → 100% 20 min 直線グラジエント
    検 出 UV 340 nm
    サンプル

    Soft drink

    1. (L)Ornithine-(D)DLDA
    流 速 1.0 mL/min 注入量

    1.0 μL


    ヒスタミン(HPLC・ラベル化法 1)

    AP-histamine.png

    分析条件
    カラム COSMOSIL 5C18-AR-II 
    4.6 mm I.D. × 150 mm
    温 度 30℃
    移動相 A: 0.1 % Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 20 / 80
    B: 0.1 % Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 50 / 50
    B conc. 0 → 100% 20 min 直線グラジエント
    検 出 UV 340 nm
    サンプル
    1. Histamine-(D)DLDA
    流 速 1.0 mL/min 注入量

    1.0 μL

    アミノ酸以外のアミン化合物やチオール化合物にも適用可能です。

    価格表

    製品名規格貯法製品番号容量オンライン
    カタログへ
    DL-Amino Acid Labeling Kit SP 冷所 19942-74 100 tests e-Nacalai.jpg

    本製品に使用するラベル化剤は京都大学が特許出願し、ナカライテスク株式会社が許諾を得て製造販売しています。

    HPLC 用ラベル化剤

    アミノ酸や脂質など検出が難しい化合物をラベル化することにより、高感度検出が可能になります。また、他成分との分離の向上も期待できます。弊社では各種ラベル化剤をご用意しています。

    可視ラベル化剤

    Dabsyl Chloride(4-Dimethylaminoazobenzene-4'-sulfonyl Chloride)

    AP-0438.png

    分析条件
    カラム COSMOSIL 5C18-MS-II
    4.6 mm I.D. × 150 mm
    移動相 Methanol / 20 mmol/L Phosphoric Acid = 70 / 30
    流 速 1.0 mL/min
    温 度 30℃
    検 出 UV 430 nm, 2.56 AUFS
    サンプル
    1. Dabsyl-Glycine
    2. Dabsyl-L-Alanine
    3. Dabsyl-L-Valine
    4. Dabsyl-L-Leucine


    C14H14ClN3O2S
    M.W.=323.80

    本製品は暗赤色結晶、m.p.185 ~ 188℃ (dec.)、水にはほとんど溶けない。アセトンにわずかに溶ける。
    アミノ基のラベル化剤で、アミン、アミノ酸、ペプチドなどと結合し、可視部に強い吸収(最大吸収波長 430 nm)をもつ Dabsyl 誘導体を生成する。
    DNBC(3,5-Dinitrobenzoyl Chloride)に比べ約 100 倍、蛍光ラベル化剤であるダンシルクロリドと同程度の感度を有するラベル化剤です。

    例)

    1. アミノ酸のラベル化
      アミノ酸 60 nmol を 0.3 mL の炭酸ナトリウム-炭酸水素ナトリウム緩衝液(pH 8.9、0.1 mol/L)に溶かし、本製品の 10 µmol/mL アセトン溶液 0.3 mL を加え、 攪拌しながら 70℃で 6 分反応させる。
    2. ペプチドのラベル化
      サンプル 300 nmol を 0.5 mL の炭酸ナトリウム-炭酸水素ナトリウム緩衝液(pH 8.9)に溶かし、本製品の 10 µmol/mL アセトン溶液 0.5 mL を加え、70℃で 6 分反応させる。反応液を減圧乾固し、5.7N-塩酸 1.5 mL を加え、105℃で 3 時間加水分解し、HPLC のサンプルにする。

    Ref.

    1. J.K.Lin,J.Y.Chang,Anal.Chem.47,1634(1975).
    2. J.Y.Chang,E.H.Creaser,J.Chromatogr.116,215(1976).
    3. J.K.Lin,C.C.Lai,Anal.Chem.52,630(1980).

    価格表

    製品名規格貯法製品番号容 量オンライン
    カタログへ
    Dabsyl Chloride SP 室温 10427-91 1 g

    UV ラベル化剤

    3,5-Dinitrobenzoyl Chloride(DNBC)

    本製品は淡黄色結晶、m.p.67 ~ 69℃、アルコール、エーテル、ベンゼンに溶ける。水酸基(R-OH)、アミノ基(R-NH2、R-NH-R')とも反応し、水酸基では 3,5-ジニトロベンゾイルエステル、アミノ基では 3,5-ジニトロンベンズアミドを生成する。

    AP-0441.png

    分析条件
    カラム COSMOSIL 5C18-MS-II
    4.6 mm I.D. × 150 mm
    移動相 Methanol / H2O = 80 / 20
    流 速 1.0 mL/min
    温 度 30℃
    検 出 UV 240 nm, 0.64 AUFS
    サンプル
    1. 3,5-Dinitrobenzoic Acid n-Propyl Ester
    2. 3,5-Dinitrobenzoic Acid n-Butyl Ester
    3. 3,5-Dinitrobenzoic Acid n-Pentyl Ester
    4. 3,5-Dinitrobenzoic Acid n-Hexyl Ester
    5. 3,5-Dinitrobenzoic Acid n-Heptyl Ester
    6. 3,5-Dinitrobenzoic Acid n-Octyl Ester


    C7H3ClN2O5
    M.W.=230.56

    例)

    サンプル数 mg をテトラヒドロフラン 5 mL に溶かし、本製品 40 mg、ピリジン 2 ~ 3 滴加えて密封し、60℃で 1 時間反応させて室温に冷却後、反応液を HPLC のサンプルにする。
    塩酸を除くためにピリジン、またはトリエチルアミンを使用した場合、分析する前処理としてクリーンアップする必要がある。
    クリーンアップ法;溶媒を除去してエーテル抽出を行い、エーテル層を希塩酸と水で洗浄する。

    Ref.

    1. T.H.Jupile,Am.Lab.8,85(1976).
    2. M.A.Carey,H.E.Persinger,J.Chromatogr.Sci. 10,573(1972).
    3. 鈴木義仁, 土屋典子, 分析化学 30,240(1981).
    4. L.J.Elrod,L.B.White,S.G.Spanton,D.G.Stroz,P.J.Cugier,L.A.Luka,Anal.Chem. 56,1786(1984).

    価格表

    製品名規格貯法製品番号容 量オンライン
    カタログへ
    3,5-Dinitrobenzoyl Chloride(DNBC) SP 冷暗所 13530-44 5 g

    蛍光ラベル化剤

    NBD Chloride(7-Chloro-4-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole)

    本製品は淡黄色結晶、m.p.95 ~ 98℃、アルコールに可溶、ダンシルクロリドより水に溶ける。
    アミノ基(R-NH2、R-NH-R')と反応して強い蛍光を発する。また、加水分解によって得られたアミノ基(カルバミド系農薬)やメルカプト基(R-SH)ともよく反応する。

    AP-0447.png

    分析条件
    カラム COSMOSIL 5C18-MS-II
    4.6 mmI.D. × 150 mm
    移動相 Methanol / 20 mmol/L Phosphoric Acid = 60 / 40
    流 速 1.0 mL/min
    温 度 30℃
    検 出 Ex.465 nm Em.520 nm, RANGE 128
    サンプル
    1. NBD-Glycine
    2. NBD-L-Alanine
    3. NBD-L-Valine
    4. NBD-L-Leucine


    C6H2ClN3O3
    M.W.=199.55

    例)

    1 ~ 20 µg のアミンを含むメタノール溶液 25 ~ 500 µL に 4 ~ 8 倍モル過剰の本製品 0.05% メタノール溶液を加え、0.1 M-炭酸水素ナトリウム 50 ~ 100 µLを加えて攪拌し、55℃ で 1 ~ 5 時間反応させ、室温と冷却後、反応液を HPLC のサンプルにする。

    Ref.

    1. J.F.Lawrence,R.W.Frei,Anal.Chem.,44,2046(1972)
    2. H.F.Van,A.Heyndrickx,Anal.Chem.,46,286(1974)
    3. H.J.Klimisch,L.Stadlen,J.Chromatogr.,90,141(1974)
    4. J.H.Wolfram,J.Chromatogr.,132,37(1977)
    5. Y.Nishikawa,K.Kuwata,Anal.Chem.,57,1864(1985)

    o-Phthalaldehyde,recryst(OPA)

    本製品は黄色結晶、m.p.56 ~ 57℃。水、多くの有機溶媒に可溶、エーテルに難溶。1 級アミン、チオール化合物と反応して蛍光を発する。

    AP-0448.png
    分析条件
    カラム COSMOSIL 5C18-MS-II
    4.6 mm I.D. × 150 mm
    移動相 Methanol / 20 mmol/L Phosphoric Acid = 70 / 30
    流 速 1.0 mL/min
    温 度 30℃
    検 出 Ex.340 nm Em.450 nm, RANGE 128
    サンプル
    1. OPA-Glycine
    2. OPA-L-Alanine
    3. OPA-L-Valine
    4. OPA-L-Leucine

    OPA-1.png
    C6H4(CHO)2
    M.W.=134.13

    OPA-2.png

    例)

    サンプル 5 mL に 10% 塩酸 0.05 mL 加えて酸性とした後、本製品の 4 mg/mL メタノール溶液 2 mL を加えて攪拌し、2-メルカプトエタノール 0.05 mL と pH 9 炭酸緩衝液 3 mL を加え、1 分室温に放置してからフィルターでろ過し、HPLC のサンプルにする。

    価格表

    製品名規格貯法製品番号容 量オンライン
    カタログへ
    NBD Chloride SP 冷蔵 24113-61  1 g
    o-Phthalaldehyde,recryst(OPA) SP 冷蔵 27824-61  1 g
    27824-74  5 g
    27824-32  25 g
    ※掲載内容は予告なく変更になる場合があります。