COSMOSIL

HPLC や LC-MS によるオリゴ核酸の不純物分析に!オリゴ核酸分析用 HFIP

1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール(HFIP)は、100 nt 未満のオリゴ核酸およびその不純物を LC-MS で分析する際の移動相調製用試薬として、高感度・高分離を示すことから汎用されています。しかしながら、メーカーや製品グレード、Lot によって、MS 感度や未知ピークの検出などが異なるという報告があります。本製品では、核酸を分析されている研究者の方々に安心してお使いいただけるように、LC-MS による実用検査を行っています。

特長

  • オリゴ核酸の HPLC・LC-MS 分析に適応
  • オリゴ核酸の不純物(short-mer, long-mer, PS → PO 変換体)の分離に適応
  • LC-MS による実用検査を実施

性能比較

市販されている HPLC グレードおよび LC-MS グレードの HFIP を用いて、オリゴ核酸(Poly(dT)19)を分析し、MS 感度を比較しました。

B-A-17-seinouhikaku-1.png
LC conditions
Column COSMOCORE 2.6C18
2.1 mm I.D. × 100 mm
Mobile phase A: 100 mM HFIP-15 mM Triethylamine (TEA)
B: Solvent A / Methanol = 1 / 1 (v / v)
B conc. 20 → 50%(0 → 20 min)
Flow rate 0.2 mL/min
Temperature 40℃
MS conditions
Equipment LCMS 2050 (Shimadzu)
Ionization ESI/APCI (Negative), TIC
Mode Scan
Mass range 550-2000
Nebulizing gas flow 2.0 L/min
Drying gas flow 5.0 L/min
Heating gas flow 7.0 L/min
DL temperature 200 ºC
Desolvation temperature 450 ºC
Interface voltage -2.0 kV

A 社製品(HPLC グレード)と比較し、本製品は MS 感度が約 2 倍高い結果となりました。また、B 社製品(LC-MS グレード)と同等の感度を示しました。


B-A-17-seinouhikaku-2.png

4 ロットを用いて比較したところ、MS 感度の差は各 Lot で約 ± 10% 以内であり、純度や金属含有量についても Lot 間差がないことを確認しています。

LC-MS 分析例

ホスホロチオアート修飾オリゴ核酸

B-A-17-LC-MS-1.png
Conditions
Column COSMOCORE 2.6C18
2.1 mm I.D. × 100 mm
Temperature 65℃
Mobile phase

A: 100 mM HFIP-15 mM Triethylamine (TEA)
B: Solvent A / Acetonitrile / Methanol = 2 / 1 / 1 (v / v / v)
B conc. 14 → 20%(0 → 20 min)
Ionization ESI/APCI (Negative), SIM
Sample conc. 100 µM (FLP) and 25 µM (others)
Flow rate 0.2 mL/min Inj. Vol.  1 µL

分離条件を最適化することで、核酸合成時に生成される可能性がある不純物を目的の核酸から分離することができます。

DNA ラダー

B-A-17-LC-MS-2.png
Conditions
Column COSMOCORE 2.6C18
2.1 mm I.D. × 100 mm
Temperature 65℃
Mobile phase

A: 100 mM HFIP-15 mM Triethylamine (TEA)
B: Solvent A / Acetonitrile / Methanol = 2 / 1 / 1 (v / v / v)
B conc. 7.5 → 27.5%(0 → 20 min)
Ionization ESI/APCI (Negative), TIC
Sample conc. 10 µM
Flow rate 0.2 mL/min Inj. Vol.  3 µL

核酸の鎖長に依存して疎水性が増大するため、長鎖の核酸ほど強く保持されます。

ssDNA(PO 体 + PS 体), ssRNA

B-A-17-LC-MS-3.png
Conditions
Column COSMOCORE 2.6C18
2.1 mm I.D. × 100 mm
Temperature 40℃
Mobile phase

A: 100 mM HFIP-15 mM Triethylamine (TEA)
B: Solvent A / Methanol = 1 / 1 (v / v)
B conc. 20 → 60%(0 → 20 min)
Ionization ESI/APCI (Negative), SIM
Sample conc. 25 µM
Flow rate 0.2 mL/min Inj. Vol.  3 µL

疎水性は RNA < DNA(PO) < DNA(PS) の順に高く、サンプルも同様の順序で溶出されます。また、DNA 配列によって疎水性が変化するため、鎖長が同様でも溶出時間は異なります。

参考文献

短鎖・中鎖・長鎖核酸の不純物分離および分取精製

Ozaki M, et al. Anal. Methods. 2024;16:1948-1956.
https://doi.org/10.1039/D4AY00114A
※ Featured on Front Cover

COSMOSIL RNA-RP1を用いた長鎖核酸の分離

Kuwayama T, et al. Anal. Sci. 2023;39:417-425.
https://doi.org/10.1007/s44211-022-00253-w
※ Selected as Hot Articles 2023


尾崎 誠 他. Medical Science Digest 12 月臨時増刊号. 2023, 49, p.40-43.


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Analytical Methods 誌 の Front Cover に掲載されたカバーアートと Analytical Sciences 誌に選定された
Hot Articles 2023 の賞状

価格表

製品名規格貯法製品番号容 量オンライン
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1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール SP(核酸分析用) 室温 22298-34 50 mL
※掲載内容は予告なく変更になる場合があります。