1. 15 mL の遠沈管にリンパ球分離溶液（d = 1.077）を 3 mL 加え室温におく。
2. その上に全血3 mL を注意深く静かに重層し、遠心分離（400 × g、室温、30 分）を行う。
3. 遠心分離後、単核球を含んでいる不透明な中間層の 0.5 cm 上のところまで上層をパスツールピペットで注意深く吸い上げ、取り除く。
4. 不透明な中間層をパスツールピペットで注意深く吸い上げ、新しい遠沈管に移す。
5. 4 の遠沈管にりん酸緩衝生理食塩水 10 mL を加え、ゆっくりと混合する。
6. 遠心分離（250 × g、室温、10 分）を行う。
7. 上澄みを注意深く吸い上げ、取り除く。
8. りん酸緩衝生理食塩水 5 mL にて沈査（単核球）を再懸濁し、パスツールピペットでゆっくりと混合する。
9. 遠心分離（250 × g、室温、10 分）を行う。⑩⑦⑧⑨の操作を再度繰り返し、上澄みを取り除き、適量のりん酸緩衝生理食塩水にて沈査（単核球）を懸濁する。

※リンパ球分離溶液（d=1.119）を同時に使用することにより、赤血球と顆粒球を分離することができます。