製品情報

Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit

本製品はアポトーシスを検出するキットです。FITCで蛍光標識したアネキシンVとPIを利用し、初期のアポトーシスと後期のアポトーシスを検出することが可能です。

特長

  • 簡便にアポトーシス初期、アポトーシス後期の観察が可能
  • 細胞の固定は不要
  • フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡で検出可能

原理

正常細胞アポトーシス初期アポトーシス後期
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正常な細胞では、膜リン脂質であるホスファチジルセリン(PS)が細胞膜の内側に存在するため、アネキシンVに認識されません。アポトーシス初期の細胞では、細胞膜構造は維持したまま、PSが細胞表面に露出してくるため、FITC標識アネキシンVに認識されて細胞表面だけが緑(FITC)に染色されます。アポトーシス後期の細胞では、細胞内にPIが取り込まれるようになり、細胞内が赤(PI)に染色されます。

実施例1

アポトーシス誘導細胞の蛍光画像

明視野観察蛍光観察

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Jurkat細胞に1 µg/mLのスタウロスポリンを37℃で3.5時間作用させてアポトーシスを誘導し、蛍光顕微鏡で観察した。

FITC標識アネキシン(緑)
PI(赤)

実施例2

アポトーシス誘導細胞のフローサイトメトリー解析

コントロール(未処理)アポトーシス誘導細胞

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Jurkat細胞に1 µg/mLのスタウロスポリンを37℃で3.5時間作用させてアポトーシスを誘導し、フローサイトメーターで解析した。

性能比較

アポトーシス検出キット性能比較

 コントロール(未処理)シクロヘキシミド処理UV処理
A社製品 image04-1.png image04-2.png image04-3.png
本製品 image04-4.png image04-5.png image04-6.png

細胞種 :マウスB16メラノーマ細胞
細胞数 :10,000個
検出装置:Gallios(ベックマン・コールター社)

シクロヘキシミドおよびUV照射(1 µg/mL)によりアポトーシスを誘導し(37℃、3.5時間)、フローサイトメーターで解析したところ、本キットはA社製品と同等の性能を有していることを示した。

未処理においては、アポトーシスは認められなかった。シクロヘキシミドでアポトーシスを誘導すると、アポトーシス初期の細胞が多数確認できた。またUV処理した細胞でもアポトーシスが確認できた。

--:FITC標識アネキシンVおよびPIの双方共に蛍光値が低い。生細胞領域。
+-:FITC標識アネキシンVの蛍光値は高く、PIは低い。アポトーシス初期。
++:FITC標識アネキシンVおよびPIの双方共に蛍光値が高い。アポトーシス後期。

データご提供:京都大学大学院 薬学研究科 病態情報薬学 高橋 有己 助教

性能評価

アポトーシス検出キット性能評価

コントロール(未処理)飢餓状態(48時間)
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細胞種 :U-87 MG 細胞
検出装置:Taliイメージサイトメーター(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)

グルコースを除き飢餓状態(48時間)によりアポトーシスを誘導し、イメージングサイトメーターで解析したところ、アポトーシス初期の細胞が確認できた。

データご提供:京都府立医科大学大学院 医学研究科 生体情報・機能形態学分野 神経発生生物学(生物学教室) 後藤 仁志 講師

キット構成

試薬名容量数量
アネキシンV-FITC溶液 250 µL 2
ヨウ化プロピジウム(PI)溶液 250 µL 2
アネキシンV結合バッファー(10倍濃縮) 10 mL 2

試薬の調製

アネキシンV結合溶液(1×)の調製

アネキシンV結合バッファー(10倍濃縮)を超純水で10倍希釈します。

使用方法

浮遊細胞

①細胞を回収し、PBSで2回洗浄します。

②アネキシンV結合溶液(1×)を用いて、最終細胞密度が1×106 cells/mLとなるように細胞を懸濁します。

③新しいチューブに、細胞懸濁液を100 µL移します。

④アネキシンV-FITC 溶液を5 µL、次にPI溶液を5 µL添加します。

⑤遮光して、室温で15分反応させます。

⑥アネキシンV結合溶液(1×)を400 µL加え、ゆっくりと混合します。

⑦できるだけ早く、フローサイトメトリー、または蛍光顕微鏡で解析します。

接着細胞

①培養液を除去します。

②PBSで細胞を2回洗浄します。

③トリプシン-EDTA溶液を用いて細胞を剥離します。

④適当量の培地、またはPBSで細胞を懸濁し、遠心用チューブに移します。

⑤遠心して細胞を回収します。

⑥細胞をPBSで2回洗浄します。

⑦アネキシンV結合溶液(1×)を用いて、最終細胞密度が1×106 cells/mLとなるように細胞を懸濁します。

⑧新しいチューブに、細胞懸濁液を100 µL移します。

⑨アネキシンV-FITC溶液を5 µL、次にPI溶液を5 µL添加します。

⑩遮光して、室温で15分反応させます。

⑪アネキシンV結合溶液(1×)を400 µL加え、ゆっくりと混合します。

⑫できるだけ早く、フローサイトメトリー、または蛍光顕微鏡で解析します。

*接着細胞は、細胞剥離操作時に特異的な細胞膜損傷を受けるため、アネキシンV-FITCのフローサイトメトリー解析には使われないこともありますが、Casciola-Rosenらやvan Engelandらにより、接着細胞を用いたフローサイトメトリーによるアネキシンVの検出方法が報告されています。

 excitation / emission
FITC標識アネキシン V 494 nm / 518 nm
PI 535 nm / 617 nm

参考文献

1. Casciola-Rosen, L., Rosen, A., Petri, M. & Schlissel, M. Proc Natl Acad Sci USA. 93(4), 1624 (1996).

2. van Engeland, M., Ramaekers, F. C., Schutte, B. & Reutelingsperger, C. P. Cytometry. 24(2), 131 (1996).

価格表

製品名貯法製品番号容量オンライン
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Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit 冷蔵 15342-54 100 tests e-Nacalai.jpg

*1 testは、細胞数1×106 cells/mLを用いたアッセイに相当します。

※記載の内容は、'17年11月現在の情報に基づいております。