翻訳効率を高める新たなキャッピング技術TriLink社 CleanCap™ Technology
mRNA へのキャッピングは、細胞内の自然免疫応答を回避するために必須です。現行では、ARCA を用いたキャッピングが主流ですが、キャップ構造が Cap 0 であるためパターン認識受容体である RIG-I に作用し、さらにキャッピング効率が低いという問題があります。TriLink 社 の CleanCap™ を用いたキャッピングでは、mRNA に Cap 1 構造が付加されるため RIG-I には作用せず、翻訳効率の高い mRNA の合成が可能です。さらにキャッピング効率も非常に高いです。TriLink 社では CleanCap™ 技術を用いたサービス・製品を提供しています。
特長
- 自然免疫応答低減（Cap 1 構造）
- キャッピング効率が高い（90～99%）
性能評価
自然免疫応答低減（CleanCap™ と ARCA の比較）
mRNA 導入キットを用いて mRNA 1 µg を導入し、24 時間後または 72 時間後に解析を行いました。
| CleanCap™ EGFP mRNA | ARCA EGFP mRNA | |
|---|---|---|
| CHO 細胞 72 時間後 |
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| 包皮線維芽細胞 24 時間後 |
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| iPS 由来心筋細胞 24 時間後 |
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CleanCap™ でキャッピングした mRNA は、ARCA と比べて自然免疫応答が低減されているため、EGFP の発現量が多くなっています。
キャッピング効率
キャッピング効率を比較した結果、CleanCap™（左）は ARCA（右）と比べてキャッピング効率が高いことが示されています。
| CleanCap™ | ARCA | |
|---|---|---|
| キャッピング効率 | 90～99% | 60～80% |
| キャップ構造 | Cap 1 | Cap 0 |
キャッピングや修飾塩基への置換が可能
mRNA 合成受託サービス
TriLink 社の in vitro 転写による RNA 合成受託サービスは、化学合成とは異なり、長鎖 RNA やキャッピングを施した RNA の合成に最適です。また、キャップ付加による免疫応答低減だけでなく、ヌクレアーゼ耐性向上のために修飾塩基を用いた合成も可能です。
特長
- さまざまなオプションを選択可能
- 幅広いスケールに対応（µg から数百 mg まで対応可能）
サービス内容
サービス内容の詳細は TriLink 社の Web site をご参照ください。
見積もり方法
TriLink 社の Web site に見積もりフォームを用意していますのでご利用ください。
https://www.trilinkbiotech.com/mRNA/quote.asp
※見積もりフォームの Notes 欄に必ず「Quotes to Nacalai」とご記入ください。
次の 1 から 3 は見積もりの際に選択していただく内容です。
1. テンプレートの選択
お客様保有のテンプレート（PCR 産物、プラスミド）を提供されるか、もしくは TriLink 社に配列の合成およびクローニングを依頼されるかを選択します。
2. 転写スケールの選択
転写スケールを選択します。以下は 1～2 kb を転写した場合の予想収量です。
| 転写スケール | RNA 収量（キャップなし） | RNA 収量（キャップあり） |
|---|---|---|
| 0.5 mL | 0.5～1.5 mg | 0.25～0.75 mg |
| 1.0 mL | 1～3 mg | 0.5～1.5 mg |
| 2.0 mL | 2～6 mg | 1～3 mg |
| 4.0 mL | 4～12 mg | 2～6 mg |
| 6.0 mL | 6～18 mg | 3～9 mg |
| 10 mL | 10～30 mg | 5～15 mg |
上記に記載のないスケールでも対応可能です。
3. オプションの選択
キャッピング |
CleanCap™、ARCA、mCAP、Vaccinia、2'-O-Methyltransferase、poly A tail などを末端に修飾することが可能です。 |
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|---|---|---|---|---|
修飾塩基 |
5-MeC、2-ThioU、N6-MeA などさまざまな修飾塩基を用いた合成が可能です。 |
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酵素処理 |
DNase 処理、ホスファターゼ処理を追加で実施可能です。 |
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CleanCap™ と改変技術の併用で免疫応答低減
修飾・改変 mRNA
合成 mRNA を自然免疫応答から回避するために、キャップ構造を付加する以外に、RNA の構成成分の一つであるウリジンの含有量を最小限に減らすこと、除去できないウリジンを修飾ウリジンに置換することが効果的であると報告されています。 TriLink 社では、CleanCap™ によるキャッピングに加え、ウリジンの含有量を削減し、かつ修飾ウリジンで置換を施した免疫応答誘導性の低い mRNA を販売しています。
特長
- 修飾・改変による免疫応答低減
性能評価
ウリジン含有量削減と修飾ウリジンの併用効果
FLuc をコードする mRNAを THP-1 細胞に導入し発現させた結果、ウリジン含有量を削減し（U depleted FLuc）、かつ 5-メトキシウリジン（5moU）で置換した mRNA が最も自然免疫応答を回避していることが示されています。
価格表
| 製品名 | メーカー 製品番号 | 容量 | オンライン カタログへ |
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|---|---|---|---|---|---|
| CleanCap™ EGFP mRNA (5moU) | L-7201-100 | 100 µg |  | ||
| L-7201-1000 | 1 mg | | |||
| L-7201-5 | 5 X 1 mg | | |||
| CleanCap™ FLuc mRNA (5moU) | L-7202-100 | 100 µg | | ||
| L-7202-1000 | 1 mg | | |||
| L-7202-5 | 5 X 1 mg | | |||
| CleanCap™ mCherry mRNA (5moU) | L-7203-100 | 100 µg | | ||
| L-7203-1000 | 1 mg | | |||
| L-7203-5 | 5 X 1 mg | | |||
| CleanCap™ Renilla Luc mRNA (5moU) | L-7204-100 | 100 µg | | ||
| L-7204-1000 | 1 mg | | |||
| L-7204-5 | 5 X 1 mg | | |||
| CleanCap™ Cas9 mRNA (modified) | L-7206-20 | 20 µg | | ||
| L-7206-100 | 100ug | | |||
| L-7206-1000 | 1 mg | | |||
| CleanCap™ Cas9 Nickase mRNA (5moU) | L-7207-20 | 20 µg | | ||
| L-7207-100 | 100 µg | | |||
| L-7207-1000 | 1 mg | | |||
| L-7207-5 | 5 X 1 mg | | |||
| CleanCap™ β-Gal mRNA (5moU) | L-7208-100 | 100 µg | | ||
| L-7208-1000 | 1 mg | | |||
| L-7208-5 | 5 X 1 mg | | |||
| CleanCap™ EPO mRNA (5moU) | L-7209-20 | 20 µg | | ||
| L-7209-100 | 100 µg | | |||
| L-7209-1000 | 1 mg | | |||
| L-7209-5 | 5 X 1 mg | | |||
| CleanCap™ OVA mRNA (5moU) | L-7210-100 | 100 µg | | ||
| L-7210-1000 | 1 mg | | |||
| L-7210-5 | 5 X 1 mg | | |||
| CleanCap™ Cre mRNA (5moU) | L-7211-100 | 100 µg | | ||
| L-7211-1000 | 1 mg | | |||
| L-7211-5 | 5 X 1 mg | | |||
| CleanCap™ EGFP mRNA | L-7601-100 | 100 µg | | ||
| L-7601-1000 | 1 mg | | |||
| L-7601-5 | 5 X 1 mg | | |||
| CleanCap™ FLuc mRNA | L-7602-100 | 100 µg | | ||
| L-7602-1000 | 1 mg | | |||
| L-7602-5 | 5 X 1 mg | | |||
| CleanCap™ Cas9 mRNA | L-7606-20 | 20 µg | | ||
| L-7606-100 | 100 µg | | |||
| L-7606-1000 | 1 mg | | |||
| L-7606-5 | 5 X 1 mg | | |||
| CleanCap™ β-Gal mRNA | L-7608-100 | 100 µg | | ||
| L-7608-1000 | 1 mg | | |||
| L-7608-5 | 5 X 1 mg | | |||
| CleanCap™ Ova mRNA | L-7610-20 | 20 µg | | ||
| L-7610-100 | 100 µg | | |||
| L-7610-1000 | 1 mg | | |||
| L-7610-5 | 5 X 1 mg | | |||
| CleanCap™ Cyanine 5 EGFP mRNA (5moU) | L-7701-100 | 100 µg | | ||
| L-7701-1000 | 1 mg | | |||
| L-7701-5 | 5 X 1 mg | | |||
| CleanCap™ Cyanine 5 FLuc mRNA (5moU) | L-7702-100 | 100 µg | | ||
| L-7702-1000 | 1 mg | | |||
| L-7702-5 | 5 X 1 mg | | |||
製品名に(5moU)もしくは(modified)が含まれる製品は、ウリジン含有量を削減し、かつ修飾ウリジンで置換した製品です。
翻訳効率の高い mRNA の合成が可能
CleanCap™ 試薬
TriLink 社では Cap 1 構造を mRNA に付加できる CleanCap™ 試薬を販売しています。ARCA と同じ手法でキャッピングすることが可能で、さらにキャッピング効率も ARCA と比べて優れています。
CleanCap™ の構造式
CleanCap™ Reagent AG(3' OMe)
価格表
| 製品名 | メーカー 製品番号 | 容量 | オンライン カタログへ |
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|---|---|---|---|---|---|
| CleanCap™ Reagent AG (3' OMe) | N-7413-1 | 1 µmole | | ||
| N-7413-5 | 5 µmoles | | |||
| N-7413-10 | 10 µmoles | | |||
キャッピング条件として T7 プロモーター配列直後の転写開始配列が AGG である必要があります。
5' TAATACGACTCACTATAAGGNNNNNNNNNNNN･･･ 3'
