ホルマリン固定-パラフィン包埋

 

凍結切片

HistoVT One で処理すると、ほかの処理と比較して、顕著に抗原性が賦活化されています。

データご提供： 独立行政法人理化学研究所 脳科学総合研究センター 発生発達研究グループ

Triton はユニオン・カーバイド・コーポレーションの登録商標です。

抗原賦活液の調製

本製品を精製水で 10 倍希釈し、緩やかに転倒攪拌を行いながら混合します。

パラフィン切片の場合

1. 抗原賦活液をドーゼ（ガラス容器）に入れて温浴槽で 90℃ に加温します。
2. 脱パラフィンしたスライドを溶液中に浸漬し、90℃ で 20 分、加温します。*¹
   （注意：インキュベート時間は、組織の種類によって異なります。また核内の物質を検出される際は 40 分加温されることをお勧めします。）
3. 抗原賦活液を精製水、あるいは緩衝液（TBS もしくは PBS）で十分に洗浄します。（3 回）
4. ブロッキングワン（#03953）などを用いてブロッキングした後、抗原抗体反応を行ってください。

凍結切片の場合

1. 抗原賦活液をドーゼ（ガラス容器）に入れて温浴槽で 70℃ に加温します。
2. ホルマリン固定し、凍結包埋した後、乾燥させた凍結切片を 70℃ で 20 分、加温します。*¹
3. 抗原賦活液を精製水あるいは緩衝液（TBS もしくは PBS）で十分に洗浄します。（3 回）
4. ブロッキングワン（#03953）などを用いてブロッキングした後、抗原抗体反応を行ってください。

（in situ ハイブリダイゼーションの一例）*2

1. 脱パラフィン処理した後、スライドを十分に洗浄します。
2. 前処理液（抗原賦活液）にスライドを浸漬し 95℃ ～ 100℃ で 40 分、加温します。*¹
3. DEPC 処理水で十分に洗浄します。
4. 切片に 70％ ホルムアミド・2 × SSC 液をマウントし 100℃ のヒートブロック上で 5 分加温します。
5. 切片から 70％ ホルムアミド・2 × SSC 液を除いた後、ドライアイスを入れたエタノールで急冷脱水します。
6. 蛍光標識したプローブを用いて、45℃ で一晩ハイブリダイズします。
7. 0.1 × SSC で洗浄します。
8. 緩衝液（TBS もしくは PBS）で洗浄します。

ご注意

*1

• 電子レンジを使用するマイクロウエーブ法では、サンプル中に気泡が発生したり、加温が不均一となる可能性があります。温浴槽を使用してください。

*2

• in situ ハイブリダイゼーションでは、必ず器具などは DNase・RNase フリーのものを使用してください。
• 水は、DEPC 処理水など DNase・RNase フリーの水を使用してください。
• ハイブリダイゼーションの温度やホルムアミド濃度などは、プローブの塩基組成によって異なりますので、あらかじめ最適な条件を確認した後、操作してください。