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カウンターステインや生死判定検出に!細胞・組織染色用蛍光色素(溶液タイプ)

蛍光染色液は免疫染色のカウンターステインから、生死判定検出、Annexin V と組み合わせたアポトーシス検出などさまざまな実験にて使用されています。波長や検出対象にあわせて、下記 7 種類の蛍光染色液をラインアップしています。

ラインアップ

色素名波長(Ex / Em)説明
Hoechst33342 350 nm / 461 nm

細胞核染色剤。免疫染色のカウンターステインに汎用されます。

Hoechst33258 352 nm / 461 nm
DAPI 360 nm / 460 nm
Propidium Iodide (PI) 535 nm / 617 nm

死細胞核染色剤。免疫染色のカウンターステインに使用される他、細胞周期の検出や Annexin V と組み合わせてアポトーシスの検出、Calcein-AM と組み合わせて生死判定などにも使用されます。


7-AAD:FITC などの色素との二重染色時、PI と比較しクロストークが小さい
EthD-III:PI と比べ、発光強度が強い

7-Aminoactinomycin D
(7-AAD)
546 nm / 647 nm
Ethidium Homodimer III (EthD-III) 522 nm / 593 nm
Calcein-AM 490 nm / 515 nm 生細胞染色剤。死細胞核染色剤と組み合わせて生死判定などに使用されます。

実施例 1

免疫染色におけるカウンターステイン

免疫染色において Hoechst33342 および PI を用いてカウンターステインを行い、蛍光顕微鏡により観察しました。

●免疫細胞染色(HeLa 細胞) ●免疫組織染色(マウス小腸)
T-183-p1-1.png T-183-p1-2.png

実験条件

●免疫細胞染色

サンプル

HeLa 細胞

固定

4%-パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液(#09154) 室温 15 分

前処理

膜透過処理;0.5% Triton® X-100 含有 PBS 室温 10 分 
ブロッキング;Blocking One Histo(#06349) 室温 10 分

一次抗体

Vimentin Antibody(Novus #NBP1-31327) 冷蔵一晩

二次抗体・染色剤

CF 488A Goat Anti-Rabbit IgG(H+L), F(ab‘)2 Fragment(Biotium #20013)、Hoechst33342 Solution(1mg/mL)(#19172-51)、
Rhodamine Phalloidin(Cytoskeleton #PHDR1)を混合 室温 1 時間

検出

Fluoro-KEEPER Antifade Reagent(#12593)を用いて封入 
落射蛍光顕微鏡(Olympus; BX-50-34-FLA1)にて観察

Triton® はユニオン・カーバイド・コーポレーションの登録商標です。

●免疫組織染色

サンプル

マウス小腸パラフィン包埋切片

抗原賦活化

HistoVT One(#06380) 90℃ 20 分

ブロッキング

Blocking One Histo(#06349)  室温 10 分

一次抗体

PCNA Antibody(Novus #NB100-456) 冷蔵一晩

二次抗体・染色剤

CF 488A Goat Anti-Rabbit IgG(H+L), F(ab‘)2 Fragment(Biotium #20013)、Propidium Iodide(PI) Solution(1mg/mL)(#19174-31)を混合 室温 1 時間

検出

Fluoro-KEEPER Antifade Reagent(#12593)を用いて封入 
落射蛍光顕微鏡(Olympus; BX-50-34-FLA1)にて観察

実施例 2

Annexin V-FITC および 7-AAD を用いたフローサイトメトリーによるアポトーシス検出

Anti-FAS 抗体によりアポトーシスを誘導させたサンプルを Annexin V-FITC および 7-AAD を用いて検出しました。Annexin V と組み合わせて使用することにより、初期のアポトーシスと後期のアポトーシスが検出可能です。また、PI の代わりに 7-AAD を使用することにより、FITC とのクロストークを小さくすることができます。

Annexin V-FITC / 7-AADAnnexin V-FITC / PI

Anti-FAS
抗体
(500 ng/mL)


6 時間処置

T-183-p2-7aad-1.png T-183-p2-pi-1.png
(顕微鏡観察) (顕微鏡観察)
蛍光観察 明視野観察 蛍光観察 明視野観察
T-183-p2-7aad-2.png T-183-p2-7aad-3.png T-183-p2-pi-2.png T-183-p2-pi-3.png
未処置 T-183-p2-7aad-4.png T-183-p2-pi-4.png

実験条件

サンプル

Jurkat 細胞

アポトーシス
誘導

Fas/TNFRSF6/CD95 Antibody (UT-1) - Azide Free(Novus #NBP1-44878) 
500 ng/mL 37℃ 6 時間

染色

[Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit(#15342-54)のプロトコールに従って染色]
1% BSA 含有 PBS を用いて 2 回洗浄を行い、アネキシン V 結合溶液(1x)に 1 X 105 cells/100 μL となるように細胞を懸濁、細胞懸濁液に各色素を添加し(詳細は、下記の通りになります)、遮光して室温 にて 15 分反応させた。


Annexin V-FITC / PI の場合 
PI は Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit(#15342-54)添付品を使用
アネキシン V-FITC 溶液 5 μL および PI 溶液 5 μL を混合

Annexin V-FITC / 7-AAD の場合 
7-AAD は 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) Solution (1mg/mL)(#19175-34)を使用
アネキシン V-FITC 溶液 5 μL およびアネキシン V 結合溶液(1x)で 50 倍希釈した 7-AAD 溶液 5 μL を混合


反応終了後、アネキシン V 結合溶液(1x)400 μL を添加

検出

アネキシン V 結合溶液(1x)添加後すぐに、フローサイトメーター(Thermo Fisher Scientific; Attune® NxT Acoustic Focusing Cytometer)および落射蛍光顕微鏡(Olympus; BX-50-34-FLA1)を用いて解析

実施例 3

Calcein-AM および EthD-III を用いたフローサイトメトリーによる生死判定検出

生細胞と死細胞を等量混合したサンプルを Calcein AM および EthD-III で染色しました。Calcein-AM 溶液と EthD-III 溶液を組み合わせることで、生死判定を行うことができます。

0.1 μM Calcein-AM / 1 μM EthD-III

0.1 μM Calcein-AM / 8 μM EthD-I
(A 社 生死判定キット)

T-183-p3-ethd3-1.png T-183-p3-ethd1-1.png
(顕微鏡観察) (顕微鏡観察)
蛍光観察 明視野観察 蛍光観察 明視野観察
T-183-p3-ethd3-2.png T-183-p3-ethd3-3.png T-183-p3-ethd1-2.png T-183-p3-ethd1-3.png

実験条件

●フローサイトメトリー

サンプル

HL-60 細胞[生細胞と死細胞(70% エタノール 30 分処置)を等量混合]

染色

1% BSA 含有 PBS に 5 X 105 cells/mL となるように細胞を懸濁 Calcein AM(#19177-14 もしくは A 社生死判定キット添付品)、および EthD-III(#19176-24)もしくは EthD-I(A 社生死判定キット添付品)を最終濃度がそれぞれ 0.1 μM、1 μM、8 μM になるように添加 室温 15分

検出

染色終了後すぐにフローサイトメーター(Thermo Fisher Scientific; Attune® NxT Acoustic Focusing Cytometer)を用いて解析

●顕微鏡観察

サンプル

HL-60 細胞[生細胞と死細胞(70% エタノール 30 分処置)を等量混合]

染色

1% BSA 含有 PBS に 2 X 104 cells/100 μL となるように細胞を懸濁 Calcein AM(#19177-14 もしくは A 社生死判定キット添付品)、および EthD-III(#19176-24)もしくは EthD-I(A 社生死判定キット添付品)を最終濃度がそれぞれ 0.1 μM、1 μM、8 μM になるように添加 室温 15 分

検出

染色終了後すぐに落射蛍光顕微鏡(Olympus; BX-50-34-FLA1)を用いて解析

価格表

製品名貯法製品番号容量オンライン
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Hoechst33342 Solution(1mg/mL) 冷蔵 19172-51 1 mL e-Nacalai.jpg
Hoechst33258 Solution(1mg/mL)  冷蔵 19173-41 1 mL e-Nacalai.jpg
DAPI Solution(1mg/mL)  冷蔵 19178-91 1 mL e-Nacalai.jpg
Calcein-AM Solution(1mmol/L) 冷凍 19177-14 0.2 mL e-Nacalai.jpg
Propidium Iodide(PI) Solution(1mg/mL)  冷蔵 19174-31 1 mL e-Nacalai.jpg
7-Aminoactinomycin D(7-AAD) Solution(1mg/mL) 冷凍 19175-34 0.2 mL e-Nacalai.jpg
Ethidium Homodimer Ⅲ(EthD-Ⅲ) Solution(1mmol/L)  冷蔵 19176-24 0.2 mL e-Nacalai.jpg

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