カウンターステインや生死判定検出に！細胞・組織染色用蛍光色素（溶液タイプ）
蛍光染色液は免疫染色のカウンターステインから、生死判定検出、Annexin V と組み合わせたアポトーシス検出などさまざまな実験にて使用されています。波長や検出対象にあわせて、下記 7 種類の蛍光染色液をラインアップしています。
ラインアップ
| 色素名 | 波長（Ex / Em） | 説明 |
|---|---|---|
| Hoechst 33342 | 350 nm / 461 nm |
細胞核染色剤。免疫染色のカウンターステインに汎用されます。 |
| Hoechst 33258 | 352 nm / 461 nm | |
| DAPI | 360 nm / 460 nm | |
| Propidium Iodide (PI) | 535 nm / 617 nm |
死細胞核染色剤。免疫染色のカウンターステインに使用される他、細胞周期の検出や Annexin V と組み合わせてアポトーシスの検出、Calcein-AM と組み合わせて生死判定などにも使用されます。 7-AAD：FITC などの色素との二重染色時、PI と比較しクロストークが小さい |
| 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) |
546 nm / 647 nm | |
| Ethidium Homodimer III (EthD-III) | 522 nm / 593 nm | |
| Calcein-AM | 490 nm / 515 nm | 生細胞染色剤。死細胞核染色剤と組み合わせて生死判定などに使用されます。 |
実施例 1
免疫染色におけるカウンターステイン
免疫染色において Hoechst 33342 および PI を用いてカウンターステインを行い、蛍光顕微鏡により観察しました。
| ●免疫細胞染色（HeLa 細胞） | ●免疫組織染色（マウス小腸） |
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実験条件
●免疫細胞染色
| サンプル |
HeLa 細胞 |
|---|---|
| 固定 |
4%-パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液（#09154） 室温 15 分 |
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前処理 |
膜透過処理；0.5% Triton® X-100 含有 PBS 室温 10 分 |
| 一次抗体 |
Vimentin Antibody（Novus #NBP1-31327） 冷蔵一晩 |
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二次抗体・染色剤 |
CF 488A Goat Anti-Rabbit IgG(H+L), F(ab‘)2 Fragment（Biotium #20013）、Hoechst 33342 Solution(1mg/mL)（#19172-51）、 |
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検出 |
Fluoro-KEEPER Antifade Reagent（#12593）を用いて封入 |
Triton® はユニオン・カーバイド・コーポレーションの登録商標です。
●免疫組織染色
| サンプル |
マウス小腸パラフィン包埋切片 |
|---|---|
| 抗原賦活化 |
HistoVT One（#06380） 90℃ 20 分 |
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ブロッキング |
Blocking One Histo（#06349） 室温 10 分 |
| 一次抗体 |
PCNA Antibody（Novus #NB100-456） 冷蔵一晩 |
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二次抗体・染色剤 |
CF 488A Goat Anti-Rabbit IgG(H+L), F(ab‘)2 Fragment（Biotium #20013）、Propidium Iodide(PI) Solution(1mg/mL)（#19174-31）を混合 室温 1 時間 |
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検出 |
Fluoro-KEEPER Antifade Reagent（#12593）を用いて封入 |
実施例 2
Annexin V-FITC および 7-AAD を用いたフローサイトメトリーによるアポトーシス検出
Anti-FAS 抗体によりアポトーシスを誘導させたサンプルを Annexin V-FITC および 7-AAD を用いて検出しました。Annexin V と組み合わせて使用することにより、初期のアポトーシスと後期のアポトーシスが検出可能です。また、PI の代わりに 7-AAD を使用することにより、FITC とのクロストークを小さくすることができます。
| Annexin V-FITC / 7-AAD | Annexin V-FITC / PI | |||
|---|---|---|---|---|
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Anti-FAS 6 時間処置 |
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| （顕微鏡観察） | （顕微鏡観察） | |||
| 蛍光観察 | 明視野観察 | 蛍光観察 | 明視野観察 | |
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| 未処置 |  |
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実験条件
| サンプル |
Jurkat 細胞 |
|---|---|
| アポトーシス 誘導 |
Fas/TNFRSF6/CD95 Antibody (UT-1) - Azide Free（Novus #NBP1-44878） |
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染色 |
[Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit（#15342-54）のプロトコールに従って染色] Annexin V-FITC / PI の場合 Annexin V-FITC / 7-AAD の場合 反応終了後、アネキシン V 結合溶液（1x）400 μL を添加 |
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検出 |
アネキシン V 結合溶液（1x）添加後すぐに、フローサイトメーター（Thermo Fisher Scientific; Attune® NxT Acoustic Focusing Cytometer）および落射蛍光顕微鏡（Olympus; BX-50-34-FLA1）を用いて解析 |
実施例 3
Calcein-AM および EthD-III を用いたフローサイトメトリーによる生死判定検出
生細胞と死細胞を等量混合したサンプルを Calcein AM および EthD-III で染色しました。Calcein-AM 溶液と EthD-III 溶液を組み合わせることで、生死判定を行うことができます。
| 0.1 μM Calcein-AM / 1 μM EthD-III |
0.1 μM Calcein-AM / 8 μM EthD-I | ||
|---|---|---|---|
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| （顕微鏡観察） | （顕微鏡観察） | ||
| 蛍光観察 | 明視野観察 | 蛍光観察 | 明視野観察 |
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実験条件
●フローサイトメトリー
| サンプル |
HL-60 細胞[生細胞と死細胞（70％ エタノール 30 分処置）を等量混合] |
|---|---|
| 染色 |
1% BSA 含有 PBS に 5 X 105 cells/mL となるように細胞を懸濁 Calcein AM（#19177-14 もしくは A 社生死判定キット添付品）、および EthD-III（#19176-24）もしくは EthD-I（A 社生死判定キット添付品）を最終濃度がそれぞれ 0.1 μM、1 μM、8 μM になるように添加 室温 15分 |
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検出 |
染色終了後すぐにフローサイトメーター（Thermo Fisher Scientific; Attune® NxT Acoustic Focusing Cytometer）を用いて解析 |
●顕微鏡観察
| サンプル |
HL-60 細胞[生細胞と死細胞（70％ エタノール 30 分処置）を等量混合] |
|---|---|
| 染色 |
1% BSA 含有 PBS に 2 X 104 cells/100 μL となるように細胞を懸濁 Calcein AM（#19177-14 もしくは A 社生死判定キット添付品）、および EthD-III（#19176-24）もしくは EthD-I（A 社生死判定キット添付品）を最終濃度がそれぞれ 0.1 μM、1 μM、8 μM になるように添加 室温 15 分 |
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検出 |
染色終了後すぐに落射蛍光顕微鏡（Olympus; BX-50-34-FLA1）を用いて解析 |
価格表
| 製品名 | 貯法 | 製品番号 | 容量 | オンライン カタログへ |
|---|---|---|---|---|
| Hoechst 33342 Solution(1mg/mL) | 冷蔵 | 19172-51 | 1 mL |  |
| Hoechst 33258 Solution(1mg/mL) | 冷蔵 | 19173-41 | 1 mL | |
| DAPI Solution(1mg/mL) | 冷蔵 | 19178-91 | 1 mL | |
| Calcein-AM Solution(1mmol/L) | 冷凍 | 19177-14 | 0.2 mL | |
| Propidium Iodide(PI) Solution(1mg/mL) | 冷蔵 | 19174-31 | 1 mL | |
| 7-Aminoactinomycin D(7-AAD) Solution(1mg/mL) | 冷凍 | 19175-34 | 0.2 mL | |
| Ethidium Homodimer Ⅲ(EthD-Ⅲ) Solution(1mmol/L) | 冷蔵 | 19176-24 | 0.2 mL | |
Attune® はライフテクノロジーズコーポレーションの登録商標です。
