COSMOSIL

HPLC によるアミノ酸分析時の誘導体化に !DL-アミノ酸ラベル化キット

本製品はアミノ酸を HPLC 分析の前にラベル化(誘導体化)するためのキットです。アミノ酸は親水性が高く UV 吸収が小さいため、ラベル化してから HPLC 分析することが多用されています。また、近年、D 体のアミノ酸が注目されていますが、イソチオシアン酸フェニルやダンシルクロリドなどの汎用的なラベル化剤では、D 体と L 体とを分離するには高価なキラルカラムが必要です。
本製品を使用すると煩雑なラベル化を簡単に行えるだけではなく、不斉炭素を含有するラベル化剤 D-FDLDA を採用しているため、ラベル化したアミノ酸を C18 などのアキラルカラムで光学分離することができます。もちろん、従来のラベル化剤と同様に L 体のアミノ酸の分析にも使用することができます。

キーワード:食品、メタボロミクス、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、HPLC、LC-MS、LC-MS/MS

特長

  • 調製済みのキットなので、誰でも簡単にアミノ酸が分析可能
  • キラルカラムを使わずにアミノ酸の光学異性体を分離
  • MS(質量分析計)での高感度検出
  • ラベル化アミノ酸の安定性が高い

ラベル化法

キットの構成(100 回測定用)(ユーザー準備品も含む)

名称キット容量添加量 / 回ラベル化剤
サンプル溶液*1 ユーザー準備品 100 µL 03_08_kit.png
ラベル化剤溶液*2 10 mL 100 µL
反応開始液 10 mL 100 µL
脱ラベル化液(側鎖用)*3 10 mL 100 µL
反応停止液 10 mL 100 µL
メタノールやアセトニトリルなど ユーザー準備品 500 µL or 600 µL
*1 反応する官能基の総 mol 量は 1.0 µmol 以下にしてください。濃い場合には、サンプルを希釈するか添加量を減らしてください。また、ラベル化(誘導体化)の際には、サンプル溶液は中性にしてください。
*2 本液には、ラベル化剤 D-FDLDA を採用しています。
*3 本液には、6-Mercapto-1-hexanol [M.W.: 134.24(C6H14OS)]を含みます。

 

2 種類のラベル化法

本製品に採用されているラベル化剤 D-FDLDA はアミノ基と反応します。また、チロシンのフェノール性水酸基やシステインのチオール基などの一部側鎖もラベル化されます。ラベル化法 1 の操作 2 でアミノ酸の側鎖(Lys を除く)のラベル化剤を除去することができます。

03_08_2types.png

サンプル中に含まれるアミノ酸が未知である場合はラベル化法 1 からお試しください。

 

操作方法

03_08_Protocol_1-2_text.png

 

03_08_Protocol_step1-2.png

 

  • 測定サンプルにキットの溶液を添加して加熱する操作だけで、ラベル化反応が進行します。
  • 脱ラベル化液を添加した際に色の変化(黄色 → 濃橙色)が無い場合は、 サンプルの濃度が高く、未ラベル化状態のものが存在している可能性があるため、サンプルを希釈してラベル化されることを推奨します。

 

HPLC で検出されるラベル化剤由来のピーク

名称分子量説明
D-FDLDA 385.39 (C16H24FN5O5) 未反応のラベル化剤(ラベル化法 2 のみ)
D-FDLDA(Hydrolysed) 383.40 (C16H25N5O6) ラベル化剤の加水分解物
D-DLDA-S-C6H12OH 499.63 (C22H37N5O6S) ラベル化剤と脱ラベル化剤(側鎖用)の反応物(ラベル化法 1 のみ)

実際のサンプルを分析する前にブランク分析を必ず行ってください。

HPLC 分析例

UV 検出による各アミノ酸の DL 体の分離(ラベル化法 1)

グリシンを除く 19 種類のアミノ酸の D 体と L 体とを分離することができました。

↓ クリックすると拡大します

03_08_P1-HPLC_800px.png

Conditions
Column COSMOSIL 5C18-AR-II 
4.6 mm I.D. × 150 mm
Flow rate 1.0 mL/min
Mobile phase A: 0.1% Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 20 / 80
B: 0.1% Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 50 / 50
B conc. 0 → 100% 20 min Linear gradient
Temperature 30℃
Detection UV 340 nm
Sample DL-Amino Acid-D-DLDA derivatives

LC-MS 分析例

LC-MS 分析による各アミノ酸の DL 体の分離(ラベル化法 1)

19 種類の DL-アミノ酸および Gly を含むアミノ酸の一斉分離をしたところ、すべてのアミノ酸の L 体と D 体を分離することができました。

03_08_LCMS.png
Conditions
Column COSMOCORE 2.6C18 
2.1 mm I.D. × 100 mm
Flow rate 0.4 mL/min
Mobile phase A: 0.1% Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 10 / 90
B: 0.1% Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 50 / 50
B conc. 0 → 10 → 60 → 100%(0 → 5 → 30 → 35 min)
Temperature 40℃
Detection ESI(+)-MS

従来のキラル型ラベル化剤との比較

従来の Merfey 試薬との比較

アキラルカラムによるアミノ酸の光学分離では、Marfey 法による Nα-(5-Fluoro-2,4-dinitrophenyl)-L-alaninamide [L-FDAA] や Nα-(5-Fluoro-2,4-dinitrophenyl)-L-leucinamide [L-FDLA] などのラベル化剤が知られていますが、本製品のラベル化剤である D-FDLDA は下図の赤丸で囲んだ構造がイオン化しやすいため、UV での感度は既存品と同等ですが、MS での感度は高まります(下図赤枠)。なお、本製品では D 体のラベル化剤を使用しているため溶出順が逆です。

03_08_Mergey.png

 

Conditions
Column COSMOCORE 2.6C18 
2.1 mm I.D. × 100 mm
Flow rate 0.2 mL/min
Mobile phase A: 0.1% Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 20 / 80
B: 0.1% Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 70 / 30
B conc. 0 → 100% 20 min Linear gradient
Temperature 40℃
Detection UV 340 nm, ESI(+)-MS
Sample Labeled Leucine
1.  D form
2.  L form

アキラル型ラベル化剤との比較

下記の 4 種類のラベル化試薬を用いて、プレカラムラベル化法による比較を行いました。

(1)#19942-74 DL-アミノ酸ラベル化キット
(2)#10427-91 ダブシルクロリド
(3)#27810-44 o-フタルアルデヒド
(4)#27333-04 イソチオシアン酸フェニル ※ラベル化サンプルの安定性データのみ

アミノ酸の DL 分離

ラベル化した DL-フェニルアラニンを C18 カラムで分析を行いました。(2)(3)のようなアキラル型ラベル化剤ではアミノ酸の DL 体を分離できませんが、(1)DL-アミノ酸ラベル化キットは、ラベル化試薬の構造中に不斉炭素を有し、アミノ酸の D 体と L 体とがジアステレオマーの関係になるために分離することができます。


DL-767.png
Conditions
Column COSMOSIL 2.5C18-MS-II 
2.0 mm I.D. × 50 mm
Detection UV(1)340 nm,(2)430 nm,(3)241 nm
Mobile phase A: 0.1% Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 20 / 80
B: 0.1% Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 80 / 20
B conc. 0 → 100% 10 min Linear gradient
Sample

Labeled DL-Phenylalanine

Sample concentration

0.01 mg/mL (as DL-Phenylalanine)

Flow rate 0.2 mL/min Labeling reagents

(1)DL-Amino Acid Labeling Kit
(2)Dabsyl Chloride
(3)o-Phthalaldehyde

Temperature 40℃ Injection vol.

1.0 μL

o-フタルアルデヒドでラベル化されたアミノ酸は、一般的には蛍光検出器を使用して分析します。

質量分析計(MS)での検出感度

ラベル化した L-フェニルアラニンの MS での感度比較を行いました。DL-アミノ酸ラベル化キットのラベル化試薬やダブシルクロリドはイオン化しやすい構造であるため、MS での検出感度が高くなりました。なお、(4)イソチオシアン酸フェニル(PITC)から生成する PTC アミノ酸の推奨移動相は MS で使用することはできません。


L-733.png
Conditions
Column COSMOSIL 2.5C18-MS-II 
2.0 mm I.D. × 50 mm
Detection ESI(+)-MS
Mobile phase A: 0.1% Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 20 / 80
B: 0.1% Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 80 / 20
B conc. 0 → 100% 10 min Linear gradient
Sample

Labeled L-Phenylalanine

Sample concentration

0.01 mg/mL (as L-Phenylalanine)

Flow rate 0.2 mL/min Labeling reagents

(1)DL-Amino Acid Labeling Kit
(2)Dabsyl Chloride
(3)o-Phthalaldehyde

Temperature 40℃ Injection vol.

1.0 μL

ラベル化サンプルの安定性

ラベル化した L-フェニルアラニンを反応日から 1 日後、3 日後、7 日後に HPLC 分析を行いました。o-フタルアルデヒドでラベル化したサンプルは安定性が低いため、マニュアル操作によるラベル化には適さず、分析装置中でのオンライン分析での使用に限定した方が良いと考えられます。また、PITC でラベル化したサンプルもわずかに安定性が低下することが示されました。

ラベル化サンプルの安定性

反応後
日数
DL-アミノ酸ラベル化キットo-フタルアルデヒドダブシルクロリドPITC
1 100% 100% 100% 100%
3 113% 0% 95% 81%
7 106% 0% 96% 83%

※ 反応後 1 日目のピーク面積を 100% とした。PITC でラベル化したサンプルは冷凍保存、それ以外のサンプルは冷蔵保存

ペプチドの組成分析

アミノ酸混合物の分析

ペプチドの加水分解後に検出可能なアミノ酸を DL-アミノ酸ラベル化キットでラベル化した後、LC-MS で一斉分析しました。

03_08_peptide.png

 

Conditions
Column COSMOCORE 2.6C18 
2.1 mm I.D. × 100 mm
Temperature 40℃
Mobile phase A: 0.1% Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 10 / 90
B: 0.1% Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 50 / 50
B conc. 0 → 25 → 45 → 67%(0 → 3 → 15 → 30 min)
Detection ESI(+)-MS
Injection vol. 1.0 μL
Flow rate 0.4 mL/min L-(Cys)2 は L-Cys として検出

加水分解したペプチドのアミノ酸分析

N 末端の Val が L 体、中央の Val が D 体であるペプチド(H-VRVAA-NH2 : LLDLL-form)を加水分解した後、DL-アミノ酸ラベル化キット、および、本用途に汎用される PITC でラベル化しました。
PITC で標識したところ、D-Val と L-Val のピークが完全に重なり、ラセミ化の識別はできません。一方、DL-アミノ酸ラベル化キットで標識することにより、アミノ酸を光学分離することができるため、合成したペプチドのラセミ化の有無の確認にも使用することができます。

 

DL-アミノ酸ラベル化キット
03_08_kasuibunkai_kit.png
PITC
03_08_kasuibunkai_PITC.png
Amino Acid
(AA)
AA ResidueContents
DL-アミノ酸ラベル化キットPITC
L-Arg 1 0.8 0.7
D-Val 1 1.0 n.d.*1
L-Ala 2 2.0 2.0
L-Val 1 1.1 1.8

*1 D-Val は L-Val として検出

Conditions
Column COSMOCORE 2.6C18
2.1 mm I.D. × 100 mm
Mobile phase A: 0.1% Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 10 / 90
B: 0.1% Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 50 / 50
B conc. 0 → 90%(0 → 10 min)
Flow rate 0.4 mL/min
Temperature 40℃
Detection UV 340 nm
Conditions
Column COSMOCORE 2.6C18
2.1 mm I.D. × 100 mm
Mobile phase A: Acetonitrile / 60 mM Sodium Acetate(pH 6.0)= 5 / 95
B: Acetonitrile / 60 mM Sodium Acetate(pH 6.0)= 60 / 40
B conc. 0 → 60%(0 → 10 min)
Flow rate 0.4 mL/min
Temperature 40℃
Detection UV 254 nm

ラベル化反応の進行と定量性

アミノ酸のラベル化反応

ラベル化方法によって、結合するラベル化剤の数が異なる DL-Tyr を用いて、ラベル化反応の継時変化を測定したところ、反応開始から 2 時間でアミノ酸に完全にラベル化されることが示されました。

03_08_Protocol1-2.png

ラベル化した DL-アミノ酸の DL 体の比率

03_08_hiritsu.png

2 時間ラベル化を行った後の各 DL-アミノ酸のピーク面積値から DL 体の比率を算出したところ、正確に 1 : 1 でラベル化されていることが分かりました。また、個別に反応させた D 体、および、L 体のアミノ酸の光学純度(e.e.)を確認したところ、全てのアミノ酸において、光学純度は 100% でした。

ペプチドのラベル化反応

アミノ酸だけでなく、短鎖ペプチドにおいても、配列の長さやラベル化剤の結合部位の数に関わらず、アミノ酸と同様にラベル化することができました。

03_08_peptide_labeling.png
PeptidesCarnosineGlutathioneTuftsin

Sequence

H-βAla-His-OH*1 H-Glu-Cys-Gly-OH H-Thr-Lys-Pro-Arg-OH

Amino acid residues

2 3 4
Labeling reagent binding sites 1 1 2*2

*1 βAla: β-アラニン  *2 Lys 側鎖のアミノ基に結合するため 2 つのラベル化剤が結合

検量線

濃度の異なるアミノ酸水溶液を本製品によりラベル化し HPLC で分析したところ、直線的な検量線が作成できました。

03_08_kenryousen.png

ラベル化反応

  • ラベル化法 1 : L-Tyr(mono
  • ラベル化法 2 : L-Tyr(di)、L-Val、L-Pro

その他分析例

Thr の 4 種類の異性体の分離 (HPLC・ラベル化法 1)

03_08_Thr4.png 03_08_Thr4-2.png
Conditions
Column COSMOCORE 2.6C18 
2.1 mm I.D. × 100 mm
Flow rate 0.4 mL/min
Mobile phase A: 0.1% Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 20 / 80
B: 0.1% Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 50 / 50
B conc. 0 → 90% (0 → 10 min)
Temperature 40℃
Detection UV 340 nm
Injection volume 0.5 µL

 

C18 カラムでは分離することが難しい塩基性化合物の一斉分離(LC-MS・ラベル化法 1)

03_08_enkikagoubutu.png
Conditions
Column COSMOSIL 3PBr  
3.0 mm I.D. × 150 mm
Flow rate 0.4 mL/min
Mobile phase A: 0.1% Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 20 / 80
B: 0.1% Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 60 / 40
B conc. 25 → 25 → 45 → 100% (0 → 5 → 15 → 30 min)
Temperature 40℃
Detection ESI(+)-MS

※ 5-Hydroxy-DL-Lys, L-Ornithine, L-Lys: double charged peak
    Other compounds: single charged peak

 

COSMOSIL PBr の製品情報はこちら

 

スポーツ飲料(HPLC・ラベル化法 2)

AP-Suport.png

Conditions
Column COSMOSIL 5C18-AR-II 
4.6 mm I.D. × 150 mm
Temperature 30℃
Mobile phase A: 0.1% Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 20 / 80
B: 0.1% Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 50 / 50
B conc. 0 → 100% 20 min Linear gradient
Detection UV 340 nm
Sample

Sports drink

  1. L-Arg-D-DLDA
  2. L-Val-D-DLDA
  3. L-Ile-D-DLDA
  4. L-Leu-D-DLDA
Flow rate 1.0 mL/min Injection vol.

2.0 μL


回復系アミノ酸飲料(HPLC・ラベル化法 2)

AP-kaifukukei.png

Conditions
Column COSMOSIL 5C18-AR-II 
4.6 mm I.D. × 150 mm
Temperature 30℃
Mobile phase A: 0.1% Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 20 / 80
B: 0.1% Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 50 / 50
B conc. 0 → 100% 20 min Linear gradient
Detection UV 340 nm
Sample

Soft drink

  1. L-Ornithine-D-DLDA
Flow rate 1.0 mL/min Injection vol.

1.0 μL


ヒスタミン(HPLC・ラベル化法 1)

AP-histamine.png

Conditions
Column COSMOSIL 5C18-AR-II 
4.6 mm I.D. × 150 mm
Temperature 30℃
Mobile phase A: 0.1% Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 20 / 80
B: 0.1% Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 50 / 50
B conc. 0 → 100% 20 min Linear gradient
Detection UV 340 nm
Sample
  1. Histamine-D-DLDA
Flow rate 1.0 mL/min Injection vol. 1.0 μL

 

イミダゾールジペプチドの分離(HPLC・ラベル化法 1)

03_08_imidasolpeptide.png 03_08_structure.png

Conditions
Column COSMOSIL 5C18-AR-II 
3.0 mm I.D. × 150 mm
Temperature 40℃
Mobile phase A: 0.1% Formic Acid - Acetonitrile / H2O = 10 / 90
B: 0.1% Formic Acid - Acetonitrile/ H2O = 50 / 50
B conc. 20 → 40% (0 → 20 min)
Detection UV 340 nm
Flow rate 0.4 mL/min Injection vol. 1.0 μL

 

アミノ酸以外のアミン化合物やチオール化合物にも適用可能です。

参考文献

本ラベル化キットのラベル化剤 D-FDLDA の解説(L-FDVDA, #20363-24 の解説もされています)

Kuranaga, T.; Minote, M.; Morimoto, R.; Pan, C.; Ogawa, H.; Kakeya, H. Highly Sensitive Labeling Reagents for Scarce Natural Products. ACS Chem. Biol. 2020, 15(9), p. 2499-2506
https://doi.org/10.1021/acschembio.0c00517

Kuranaga, T.; Kakeya, H.; Chapter Five - Development and application of highly sensitive labeling reagents for amino acids. Methods in Enzymol. 2022, 665, p. 105-133
https://doi.org/10.1016/bs.mie.2021.11.004

ペプチド中の DL 体の識別

Ozaki, M.; Kuwayama, T.; Hirose, T.; Hashimoto, A.; Kuranaga, T.; Kakeya, H. Separation and identification of the DL-forms of short-chain peptides using a new chiral resolution labeling reagent. Anal. Bioanal. Chem. 2022, 414, p. 4039-4046
https://doi.org/10.1007/s00216-022-04048-w

※ ラベル化(誘導体化)したアミノ酸を分析したデータは ”Surpplementary information” に掲載されています。

価格表

製品名規格貯法製品番号容量オンライン
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DL-Amino Acid Labeling Kit SP 冷所 19942-74 100 tests e-Nacalai.jpg

本製品に使用するラベル化剤は京都大学が特許出願し、ナカライテスク株式会社が許諾を得て製造販売しています。

※掲載内容は予告なく変更になる場合があります。