ナカライテスク株式会社

Cosmosil
HPLC や LC/MS によるアミノ酸分析時の誘導体化に !

L-FDVDA (1-Fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-valine-N,N-dimethylethylenediamineamide)

本製品は高感度タグを修飾したアミノ基結合型の光学分割ラベル化剤(キラルラベル化剤)であり[3, 4]、高速液体クロマトグラフィー・質量分析計(LC-MS)で高感度に光学異性体を分離・識別することができます。DL-アミノ酸ラベル化キットでは分離・識別することが難しいサンプル(イソロシンの立体異性体やアミノ酪酸の異性体)のラベル化(誘導体化)にご使用ください。

関連製品 : DL-アミノ酸ラベル化キットの製品情報はこちら

 

特長
  • キラルカラムを使わずに光学異性体を分離
  • MS(質量分析計)での高感度検出
  • ラベル化したサンプルの安定性が高い 適用サンプル : イソロシン(Ile)の 立体異性体(DL-Ile, DL-allo-Ile)、アミノ酪酸の異性体、ペプチドの配列解析

適用サンプル : イソロシン(Ile)の 立体異性体(DL-Ile, DL-allo-Ile)、アミノ酪酸の異性体、ペプチドの配列解析

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製品説明

ラベル化法

ラベル化剤  
L-FDVDA_kouzousiki.png ・本ラベル化剤 L-FDVDA はアミノ基と反応します。
※フェノール性水酸基やチオール基にも反応しますが、DL-アミノ酸ラベル化キットの脱ラベル化液(側鎖用)を使用することで、脱離させることができます。
・ラベル化反応には、DL-アミノ酸ラベル化キットの各種反応試薬を使用することを推奨します(ラベル化剤以外の構成試薬は個別で販売しています)。
※ラベル化操作と反応機構は、DL-アミノ酸ラベル化キットをご参照ください。

HPLC で検出されるラベル化剤由来のピーク

名称 分子量 説明
L-FDVDA 371.36 (C15H22FN5O5) 未反応のラベル化剤(ラベル化法 2 のみ)
L-FDVDA(Hydrolysed) 369.36 (C15H23N5O6) ラベル化剤の加水分解物
L-DVDA-S-C6H12OH 485.52 (C21H35N5O6S) ラベル化剤と脱ラベル化剤(側鎖用)の反応物(ラベル化法 1 のみ)

サンプルを分析する前にブランク分析を必ず行ってください。

 

分離困難な Ile の立体異性(DL-Ile と DL-allo-Ile)および DL-Leu の分離(ラベル化法 2)

指定難病であるメープルシロップ尿症のバイオマーカーとして注目されている DL-allo-Ile は既存の光学分割ラベル化剤やキラルカラムでは分離することが非常に難しく、精密に分離・識別することができる分析法は確立されていません。そこで、L-FDVDA でラベル化して分析したところ、C18 カラムでは、DL-Ile と DL-allo-Ile のピークが重なり、分離することができませんでしたが、コスモシール PBr カラムに変更することで DL-Ile と DL-allo-Ile、同一分子量である DL-Leu を分離・識別することができました [1]L-Ile と L-allo-Ile はベースライン分離することはできませんでしたが、ラベル化剤を D-FDLDA(DL-アミノ酸ラベル化キット)に変更することで、溶出順が逆になり分離が改善しました[1]。 ※ Ile と Leu 以外のアミノ酸も同時に分析する際は、ラベル化法 1 でラベル化を行ってください。

TN-29-p1-zu1.png
C18 column
TN-29-p3-zu5-c18.png

 

Conditions
Column COSMOSIL 3C18-AR-Ⅱ 3.0 mm I.D. × 150 mm Flow rate 0.4 mL/min
Mobile phase A : Acetonitrile / H2O / Formic Acid = 20 / 80 / 0.1
B : Acetonitrile / H2O / Formic Acid = 50 / 50 / 0.1
B conc. 10% → 60%(0 → 30 min)Linear gradient
Temperature 40℃
Detection UV 340 nm

 

 

PBr column
TN-29-p3-zu5-pbr.png

 

Conditions
Column COSMOSIL 3PBr 3.0 mm I.D. × 150 mm Flow rate 0.4 mL/min
Mobile phase A : Methanol / H2O / Formic Acid = 70 / 30 / 0.1
B : Methanol / Formic Acid = 100 / 0.1
B conc.
L-FDVDA : 0% → 0% → 30%(0 → 10→ 30 min)Linear gradient
D-FDLDA : 5% → 5% → 45%(0 → 10→ 30 min)Linear gradient
Temperature 40℃
Detection UV 340 nm

※本内容の詳細は、使用文献 [1] および「DL-allo-ThrとDL-allo-Ileを含むペプチドの配列解析」をご参照ください。

MS 感度

アキラルカラムによるアミノ酸の光学分離では、Marfey 法による Nα-(5-Fluoro-2,4-dinitrophenyl)-L-alaninamide [L-FDAA]や Nα-(5-Fluoro-2,4-dinitrophenyl)-L-leucinamide [L-FDLA]などのラベル化剤が知られていますが、本ラベル化剤 L-FDVDA は下図の赤丸で囲んだ構造がイオン化しやすいため、UV での感度は既存品と同等ですが、MS での感度は向上します [3, 4]

MSkando-LC-MS.png

本データは京都大学大学院 薬学研究科 医薬創成情報科学専攻 システムケモセラピー 制御分子学分野 教授 掛谷 秀昭様、特任講師 倉永 健史様よりご提供いただきました。

定量性

濃度の異なるアミノ酪酸を本製品によりラベル化し、LC-MS で分析したところ、直線的な検量線が作成できました [2]

teiryousei.png

ラベル化サンプルの安定性

ラベル化した各アミノ酪酸を反応日から 1 日後と 7 日後に HPLC 分析を行いました。ラベル化 1 日後と 7 日後でピーク面積値にほとんど変化が無かったため、7 日間経過してもサンプルは安定であることが示されました [2]

raberukasanpurunoannteisei.png

※ 反応終了直後に分析し、得られたピーク面積値を 100% としました。サンプルは冷蔵保存。

製品使用例

LC-MS 分析による DL-アミノ酸の分析(ラベル化法 1 )

L-FDVDA でラベル化した 20 種類の DL-アミノ酸および Gly を一斉分析 したところ、DL-allo-Thr を含む 41 個のアミノ酸の L 体と D 体を汎用的に使用される C18 カラムで分離することができました [1]。 ※ C18 カラムでは DL-Ile と DL-allo-Ile を分離することはできません。

  Analytical conditions
TN-29-p1-zu4.png LC conditions
Column COSMOSIL 3C18-AR-Ⅱ 3.0 mm I.D. × 150 mm
Mobile phase A : Acetonitrile / H2O / Formic Acid = 10 / 90 / 0.1
B : Acetonitrile / H2O / Formic Acid = 50 / 50 / 0.1
B conc. 10% → 70%(0 → 60 min)Linear gradient
Flow rate 0.4 mL/min
Temperature 40℃
MS conditions
Ionization ESI/APCI (DUIS)(positive mode)
Mode SIM
Nebrizing gas flow 2.0 L/min
Drying gas flow 5.0 L/min
Heating gas flow 7.0 L/min
DL temperature 200℃
Desolvation temperature 450℃
Interface voltage 3.0 kV

アミノ酪酸の異性体の一斉分離(ラベル化法 2)

既存の光学分割ラベル化剤やキラルカラムでは分離することが難しい 8 種類のアミノ酪酸の異性体を L-FDVDA でラベル化し、コスモシール 3C18-EB カラムを用いて分析したところ、全てのアミノ酪酸を分離 ・識別することができました(DL-BAIBA はベースライン分離できていません)[2]。また、同一分子量である N-メチル-DL-アラニンのピークとも分離することができました。

※本内容の詳細は、使用文献 [2] および「全アミノ酪酸の構造異性体と鏡像異性体の一斉分析」をご参照ください。

aminorakusanri.png
LC conditions MS conditions
Column COSMOSIL 3C18-EB 2.0 mm I.D. × 150 mm Ionization ESI/APCI (DUIS)(positive mode)
Mobile phase A : Methanol / H2O / Formic Acid = 30 / 70 / 0.1
B : Methanol / H2O / Formic Acid = 60 / 40 / 0.1
B conc.
10% → 35% →100%(0 → 40 → 60 min)Linear gradient
Mode SIM
Nebrizing gas flow 2.0 L/min
Drying gas flow 5.0 L/min
Flow rate 0.2 mL/min Heating gas flow 7.0 L/min
Temperature 40℃ DL temperature 200℃
Detection UV 340 nm Desolvation temperature 450℃
Interface voltage 3.0 kV

使用文献

■ Ile の立体異性体の分離・識別とペプチドの配列解析
[1]Ozaki M, Shimotsuma M, Kuranaga T, Kakeya H, Hirose T, Separation and identification of isoleucine enantiomers and diastereomers using an original chiral resolution labeling reagent. Chemical Pharamaceutical Bulleten. 2023;71:824-831.
 
■ 全アミノ酪酸の異性体の一斉分析
[2]Ozaki M, Shimotsuma M, Kuranaga T, Kakeya H, Hirose T, Simultaneous separation and identification of all aminobutyric acid isomers and enantiomers using a highly sensitive chiral resolution labeling reagent. Anal. Methods. 2023;15:6648-6655.
https://doi.org/10.1039/D3AY01665J
Featured on Front Cover

参考文献

■本製品の解説
[3]Kuranaga T, Minote M, Morimoto R, Pan C, Ogawa H, Kakeya H, Highly sensitive labeling reagents for scarce natural products. ACS Chem. Biol. 2020;15:2499-2506.
https://doi.org/10.1021/acschembio.0c00517
 
[4]KuranagaT, Kakeya H, Chapter Five - Development and application of highly sensitive labeling reagents for amino acids. Methods in Enzymol. 2022;665:105-133.
https://doi.org/10.1016/bs.mie.2021.11.004
 
■関連論文
[5]Morimoto R, Matsumoto T, Minote M, Yanagisawa M, Yamada R, Kuranaga T, Kakeya H, Highly sensitive determination of amino acids by LC-MS under neutral conditions. Chemical Pharamaceutical Bulleten. 2021;69:265-270.
 
[6]Jiang Y, Matsumoto T, Kuranaga T, Lu S, Wang W, Onaka H, Kakeya H, Longicatenamides A–D, two diastereomeric pairs of cyclic hexapeptides produced by combined-culture of streptomyces sp. KUSC_F05 and Tsukamurella pulmonis TP-B0596. J. Antibiot. 2021;74:307-316. https://doi.org/10.1038/s41429-020-00400-3
 
[7]Pan C, Kuranaga T, Kakeya H, Application of the highly sensitive labeling reagent to the structural confirmation of readily isomerizable peptides. J. Nat. Med. 2021;75:339-343.

関連資料

価格表

製品名 規格 貯法 製品番号 容 量 オンライン
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1-Fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-valine-N,N-dimethylethylenediamineamide SP 冷蔵 20363-24 50 mg

本製品は京都大学が特許出願し、ナカライテスク株式会社が許諾を得て製造販売しています。

COSMOSIL / コスモシールはナカライテスク株式会社の登録商標です。

関連製品

製品名 規格 貯法 製品番号 容量 オンライン
カタログへ
DL-Amino Acid Labeling Kit SP 冷暗所 19942-74 100 tests e-Nacalai.jpg
キット構成品(※ラベル化溶液以外)
Start solution(Components of DL-Amino Acid Labeling Kit) SP 室温 22191-14 10 mL e-Nacalai.jpg
Delabeling agent solution for side chain(Components of DL-Amino Acid Labeling Kit) SP 室温 22192-04 10 mL e-Nacalai.jpg
Stop solution(Components of DL-Amino Acid Labeling Kit) SP 室温 22193-94 10 mL e-Nacalai.jpg

※掲載内容は予告なく変更になる場合があります。