LifeSensors社 新規脱ユビキチン化酵素（DUB）活性測定用ユビキチン二量体基質（DiUb）
LifeSensors社のIQF-DiUb?基質は、イソペプチド結合の切断を連続してモニタリングできる脱ユビキチン化酵素基質として市場で最初に発売されました。これは、1つのユビキチンに蛍光体、他方のユビキチンにクエンチャーをそれぞれ組み込んだ内部消光蛍光（IQF）分子を作成することにより実現しました。ユビキチン間のイソペプチド結合が切断されると、クエンチャーと蛍光体が分離して蛍光が増加します。ユビキチン構造に与える影響を最小に抑えるため、蛍光体とクエンチャーは、N末端やC末端ではなくユビキチン分子内の特定の部位に結合されています。標識部位によってはDUBによる認識に影響を与えるため、各結合について標識部位が異なる複数種類のジユビキチン基質が一緒になっているパネルを用意しています。たとえば、LifeSensors社のK48結合ジユビキチンについては6種類あります。まずはジユビキチンパネルを用いて、目的結合型のどの種類を使えばお客様のアッセイ条件において最適な結果を得られるのか検討することをお勧めします。
特長
- 生理条件に最も適したDUB基質
- DUBの最適条件検討用に結合型/蛍光体の位置について多様な組み合わせをご用意
- 真のイソペプチド結合切断活性の測定
- ハイスループット対応（96および384ウェル形式で実証済み）
- 蛍光体の位置はN末端やC末端（ユビキチン構造に影響を与えることが知られている位置）以外
使用例
DUBであるAMSH coreの活性をDiUb48またはDiUb63のバリアントを用いて測定した。DUB不含のものをバックグラウンドとしてシグナル対バックグラウンドを算出した。その結果、K63のバリアント1（DU6301）に対して高い活性を示した。
K48とK63については、使用するDUBに最適な基質を選択するために、まずは全バリアントがセットになっているPanelを使用されることをお薦めします。
国内研究者使用例：基質のユビキチン結合型の違いによる脱ユビキチン化酵素活性の違い
データご提供：京都大学大学院・薬学研究科 医薬創成情報科学専攻
システムケモセラピー・制御分子学分野
服部 明 准教授
実験概要
脱ユビキチン化酵素（DUB）の活性測定では、基質としてUb-AMCなどのユビキチンC末端に蛍光色素を連結した基質が用いられており、そのC末端の消化による蛍光色素の遊離をもってDUBの活性としている。LifeSensors社が提供しているDiUbは、一方のユビキチンが他方のユビキチンのLys48またはLys63に連結した2分子のユビキチンから成る消光性蛍光基質である。それぞれの結合型基質には、蛍光色素およびクエンチャーの連結部位の違いにより6種類ある。以上の基質を用いて、ヒトUSP7とヒトUSP47の活性を測定した。
実験結果
DiUb48パネル（#DU0101）およびDiUb63パネル（#DU0102）を用いたヒトUSP7（#DB502）の活性測定
反応条件：30℃, 30min
反応液量：30µl
DiUb：200nM
USP7：0.2µg
Tris（pH8.0）：50mM
DTT：10mM
CHAPS：0.05%
反応後、蛍光プレートリーダーを用いて蛍光を測定した。
Ex/Em（nm）=540/580
Ub-AMC（#SI220）およびDiUb48-1（#DU4801）を用いたヒトUSP7（#DB502）およびヒトUSP47（#DB510）の活性測定
反応条件：30℃, 10min
反応液量：20µl
Ub-AMC：10µM
USP7またはUSP47：0.2µg
Tris（pH8.0）：50mM
NaCl：150mM
DTT：10mM
反応条件：30℃, 30min
反応液量：30µl
DiUb48-1：200nM
USP7またはUSP47：0.2µg
Tris（pH8.0）：50mM
DTT：10mM
CHAPS：0.05%
反応後、蛍光プレートリーダーを用いて蛍光を測定した。
Ub-AMC：Ex/Em（nm）=380/460；DiUb48-1：Ex/Em（nm）=540/580
使用者の評価
ヒトUSP7の脱ユビキチン化酵素活性を消光性蛍光基質であるDiUbパネルを用いて測定した結果、基質の①ユビキチンの連結様式（Lys48またはLys63）と ②蛍光色素/クエンチャーの標識部位の違いによって異なった活性プロファイルが得られた。なかでも消光性蛍光基質（DiUb48-1）に対して高い活性を示すことが分かった（上図）。
次に消光性蛍光基質（DiUb48-1）と従来基質（Ub-AMC）を基質として使用して、ヒトUSP7とヒトUSP47の酵素活性を比較した（下図）。その結果、ヒトUSP7では従来基質（Ub-AMC）に対する脱ユビキチン化酵素活性の方が高く得られ、一方、ヒトUSP47では消光性蛍光基質（DiUb48-1）に対する脱ユビキチン化酵素活性の方が顕著であった。
様々な基質を用いた検討を行い最適な基質を見つけることで各脱ユビキチン化酵素活性の測定が可能である。
価格表
| 製品名 | メーカー 製品番号 | 容量 | オンライン カタログへ |
|---|---|---|---|
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48/63 Panel |
DU0201 |
1 panel*1 |
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DiUb48-Panel |
DU0101 |
1 panel*2 |
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DiUb63-Panel |
DU0102 |
1 panel*3 |
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DiUb48-1 |
DU4801 |
50μg |
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DiUb48-2 |
DU4802 |
50μg |
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DiUb48-3 |
DU4803 |
50μg |
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DiUb48-4 |
DU4804 |
50μg |
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DiUb48-5 |
DU4805 |
50μg |
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DiUb48-6 |
DU4806 |
50μg |
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DiUb63-1 |
DU6301 |
50μg |
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DiUb63-2 |
DU6302 |
50μg |
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DiUb63-3 |
DU6303 |
50μg |
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DiUb63-4 |
DU6304 |
50μg |
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DiUb63-5 |
DU6305 |
50μg |
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DiUb63-6 |
DU6306 |
50μg |
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Ub-TAMRA Reference standard |
DU0121 |
25μg |
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*1 DiUb 48-1、DiUb 48-2、DiUb 48-3、 DiUb 48-4、 DiUb 48-5、 DiUb 48-6、DiUb 63-1、DiUb 63-2、DiUb 63-3、 DiUb 63-4、DiUb 63-5、DiUb 63-6各25μl（20μM）がセットになっています。各構成品の重量はおよそ9.2μgです。
*2 DiUb 48-1、DiUb 48-2、DiUb 48-3、 DiUb 48-4、 DiUb 48-5、 DiUb 48-6各25μl（20μM）がセットになっています。
*3 DiUb 63-1、DiUb 63-2、DiUb 63-3、 DiUb 63-4、DiUb 63-5、 DiUb 63-6各25μl（20μM）がセットになっています。
※記載の内容は、'16年4月現在の情報に基づいております
