操作手順

陰性・陽性の判断

結果が陽性でも細胞を廃棄する必要はありません。InvivoGen 社では除去試薬も用意しています。

 

MycoStrip の製品詳細は、InvivoGen 社 Web site をご参照ください。

マイコプラズマは病原性を有するものもあり、細胞に感染すると細胞内産生物も汚染されるため細胞培養を行う上で深刻な問題となっています。汚染を防ぐためには、まずは検出ステップが必要です。しかし、従来の手法では、煩雑な操作や特別な機器の必要性から、その心理的ハードルが高く、敬遠する研究者が多いのも事実です。この問題を解決するために、InvivoGen 社からは簡便にマイコプラズマ検出が行える「MycoStrip」が販売されています。
今回、医薬基盤・健康・栄養研究所様には、以前から比較的簡便で広く使われている検出法や、手間はかかるが高感度な検出法と一緒に「MycoStrip」を用いて検出感度を比較、検証いただきました。

 

データご提供：国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄養研究所 培養資源研究室（JCRB 細胞バンク）
小原 有弘 様 / 大谷 梓 様

 

実験概要

マイコプラズマ M. hyorhinis（NBRC 14858）を VERO 細胞（JCRB0111）に添加し復元培養したものを用意。これを原液として、酵素法での検出限界の濃度まで、培養上清を 5% FBS 含有 MEMで 6 倍希釈した。この希釈液を段階希釈し、60 倍、600 倍、6,000 倍、60,000 倍希釈液を調製し、酵素法、MycoStrip（等温 PCR 法）、蛍光染色法、Nested-PCR 法にて検出感度を比較した。

 

実験方法

＜使用した細胞＞
VERO 細胞 (JCRB0111)
＜使用したマイコプラズマ種＞
Mycoplasma hyorhinis (NBRC 14858)
＜使用したマイコプラズマ検出法＞
酵素法：A 社 キット（比較的簡便で広く使用されている）
等温 PCR 法：InvivoGen 社 MycoStrip（#rep-mys-10）
蛍光染色法：Hoechst 33258（0.5 µg/mL, PBS (-)）（日本薬局方参考情報）
Nested-PCR 法：ホットスタート PCR マスターミックス、検出用プライマー（日本薬局方参考情報）

 

実験結果

■ MycoStrip と 3 種の検出法の感度比較

• MycoStrip は原液、6 倍、60 倍希釈液で陽性を検出し、酵素法より 10 倍程度高い感度を示した。
• 蛍光染色法では原液、6 倍、60 倍希釈液で陽性を検出した。
• Nested-PCR 法は原液、6 倍、60 倍希釈液で陽性を検出し、600 倍、6,000 倍希釈液では 50％ の確率で陽性が示された。

■ MycoStrip

原液、6 倍、60 倍希釈液で陽性を検出し、酵素法より 10 倍程度高い感度を示した。

 

■ 蛍光染色法

原液、6 倍、60 倍希釈液で陽性を検出した（陽性：）。

 

■ Nested-PCR 法

原液、6 倍、60 倍希釈液で陽性を検出し、600 倍、6,000 倍希釈液では 50％ の確率で陽性が示された。

 

使用者の評価

検証の結果、InvivoGen 社「MycoStrip」は、比較的簡便で広く使用されている酵素法キットと比べ、10 倍程度高い感度が確認され、その他の検出法とも遜色のない感度であることが分かりました。