Bullet Blocking One for Western Blotting
本製品はウェスタンブロッティング専用のブロッキング剤です。両親媒性化合物の効果により、わずか 5 分のインキュベート時間で弊社 Blocking One と同等の性能を発揮します。
- わずか 5 分でブロッキングが完了
製品説明
Bullet Blocking One と Blocking One およびスキムミルクのブロッキング効果
超高感度検出試薬 Chemi-Lumi One Ultra を使用し、ウェスタンブロッティングを実施した。Bullet Blocking One は、わずか 5 分のブロッキング時間で、ほかの方法と同等の効果を示した。
| ブロッキング剤 ブロッキング時間 |
Bullet Blocking One 5 分 |
Blocking One 30 分 |
5% スキムミルク 60 分 |
|---|---|---|---|
| ブロッティング像 |  |
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| サンプル | : | HeLa 細胞タンパク質抽出液 20 µg より 2 倍希釈系列 |
| SDS-PAGE | : | Bullet PAGE One 5-15%（#13080-44） / 泳動用緩衝液（#30329）400 V、10 分 |
| 転写 | : | セミドライ ウェスタンブロッティング用転写緩衝液（#30650-31）10 V、30分 |
| 洗浄 | : | 0.1%-tTBS（#12750-81 を 10 倍希釈で使用） |
| ブロッキング | : | 各ブロッキング剤で各時間ブロッキング |
| 一次抗体 | : | Vimentin (C-20)-R（Santa Cruz #sc-7557-R） 2,000 倍希釈 室温、1 時間 |
| 二次抗体 | : | Goat Anti-Rabbit IgG-HRP（Santa Cruz #sc-2004） 100,000 倍希釈 室温、1 時間 |
| 検出 | : | Chemi-Lumi One Ultra（#11644）反応 5 分 LAS-3000（High モード）露光時間 15 分 |
Bullet Blocking One のブロッキング処置時間とブロッキング効果
Bullet Blocking One はスキムミルクよりも速くブロッキングが終了していることが示された。
マウス血清をドットブロットした PVDF 膜を TBS で洗浄後、Bullet Blocking One、5% スキムミルク in 0.05%-tTBS でブロッキングした。Goat Anti-Mouse IgG-HRP（Santa Cruz #sc-2005）（1 : 5,000 in 0.01%-tTBS）を反応後、0.05%-tTBS で洗浄し、Chemi-Lumi One Super（#02230）を反応させた。検出には LAS-3000（High モード）を用い、60 秒露光させて得られたデータを Multi Gauge により解析した。
他社比較 : Bullet Blocking One と他社品、従来組成ブロッキング剤との比較
Blocking One、他社品、従来組成ブロッキング剤では 5 分のブロッキング処置で十分な効果が得られない一方、Bullet Blocking One ではわずか 5 分で十分なブロッキング効果が得られた。
| 反応時間 5 分 | ブロッキング剤 | 各ブロッキング剤 添付文書記載反応時間 |
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|---|---|---|---|
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Bullet Blocking One | ||
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Blocking One |  |
30 分 |
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A 社ブロッキング剤 |  |
60 分 |
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B 社ブロッキング剤 |  |
30 分 |
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C 社ブロッキング剤 （protein-free） |
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60 分 |
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5% スキムミルク in 0.05％ Tween 20-TBS |
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60 分 |
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3% BSA in 0.05% Tween 20-TBS |
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60 分 |
マウス血清をドットブロットした PVDF 膜を TBS で洗浄後、それぞれのブロッキング剤でブロッキングした。Goat Anti-Mouse IgG-HRP（Santa Cruz #sc-2005）（1 : 5,000 in 0.01%-tTBS）を反応後、0.05%-tTBS で洗浄し、Chemi-Lumi One Super（#02230）を反応させた。検出には LAS-3000（High モード）を用い、90 秒露光した。
Tween は、クローダ インターナショナル ピーエルシーの登録商標です。
使用方法
膜を十分量の本製品に浸して 5 分振とうしてください（目安として 10 cm × 10 cm 程度の膜では本製品 50 mL を使用してください）。
Bullet Blocking One を用いた長時間のブロッキングでは、オーバーブロッキングによりシグナルが減弱する場合があります。
製品使用例
Bullet Blocking One の抗体希釈液としての使用例各ブロッキング剤の使用条件から Bullet Blocking One への移行例
本製品もしくは各ブロッキング剤でブロッキング後、さらに抗体希釈液としても本製品もしくは各ブロッキング剤を使用し、ウェスタンブロッティングを実施した。
Bullet Blocking One の抗体希釈液としての使用例
非特異バンドが出現しやすい抗体を使用した場合（上段）、本製品の原液を抗体希釈液として使用すると効果的に非特異バンドが抑制された。一方、非特異バンドが出にくい抗体を使用した場合（下段）、抗体希釈液に含有させた本製品によりオーバーブロッキングされ、感度が低下した。
| ブロッティング像 抗体 : COX4（Goat Polyclonal Antibody） |
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|---|---|---|---|---|
| ブロッティング像 抗体 : β-Actin（Mouse Monoclonal Antibody） |
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| ブロッキング剤 ブロッキング時間 |
Bullet Blocking One 5 分 |
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| 抗体希釈液 | Bullet Blocking One 20 倍希釈 |
Bullet Blocking One 5 倍希釈 |
Bullet Blocking One 原液 |
0.1%-tTBS |
各ブロッキング剤の使用条件から Bullet Blocking One への移行例
5％ スキムミルクの使用条件の場合では、本製品でブロッキング後、本製品の原液を抗体希釈液として使用すると同等の効果が得られた。一方で、Blocking One の使用条件の場合では、 本製品でブロッキング後、 本製品（20 倍希釈）を抗体希釈液として使用すると同等の効果が得られた。
| 使用条件 | 5% スキムミルクからの移行例 | Blocking One からの移行例 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| ブロッティング像 抗体 : COX4（Goat Polyclonal Antibody） |
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ブロッティング像 |
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| ブロッキング剤 ブロッキング時間 |
5% スキムミルク 60 分 |
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Bullet Blocking One 5 分 |
Blocking One 30 分 |
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Bullet Blocking One 5 分 |
| 抗体希釈液 | 5% スキムミルク | |
Bullet Blocking One 原液 |
Blocking One 20 倍希釈 |
|
Bullet Blocking One 20 倍希釈 |
| サンプル | : | HeLa 細胞タンパク質抽出液 10 µg より 2 倍希釈系列 |
| ブロッキング | : | 各ブロッキング剤で各時間反応 |
| 一次抗体 | : | 上段）COX4(D-20)（Santa Cruz #sc-69359）500 倍希釈 室温、1 時間 下段）β-Actin(C4)（Santa Cruz #sc-47778）1,000 倍希釈 室温、1 時間 |
| 二次抗体 | : | 上段）Bovine Anti-Goat IgG-HRP（Santa Cruz #sc-2350）5,000 倍希釈 室温、1 時間 下段）Goat Anti-Mouse IgG-HRP（Santa Cruz #sc-2005）20,000倍希釈 室温、1 時間 |
| 検出 | : | Chemi-Lumi One Super（#02230）反応 1 分、LAS-3000（High モード）露光時間 （上段）10 分 （下段）5 分 |
本製品はほかのブロッキング剤と同様に、ブロッキングおよび抗体希釈液の双方でご使用いただけます。ただし、本製品の抗体希釈液としての使用の適否および至適使用濃度は、使用する抗体の種類などの条件により異なります。
顧客使用例
Bullet Blocking One をブロッキングおよび抗体希釈時に使用した実施例
Bullet Blocking One は 5 分の短時間で十分なブロッキング効果を発揮できることが確認された。また、抗体の種類・品質で抗体希釈液の条件検討は必要であるが、本条件下においては、Bullet Blocking One を抗体の希釈液として用いることで強いシグナルを得ることができた。
| 条件検討 | 条件① | 条件② | 条件③ |
|---|---|---|---|
| ブロッティング像 |  |
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| ブロッキング剤 ブロッキング時間 |
Bullet Blocking One 5 分 |
Bullet Blocking One 5 分 |
5% スキムミルク 60 分 |
| 抗体希釈液 | Bullet Blocking One 20 倍希釈 |
5% スキムミルク | 5% スキムミルク |
| 一次抗体 | Anti-UCP1 2,000 倍希釈 室温、 1 時間 | ||
| 二次抗体 | Anti-Rabbit IgG 2,000 倍希釈 室温、1 時間 | ||
蛍光ウェスタンブロッティングにおいて Bullet Blocking One を使用した実施例
Bullet Blocking One を用いて 5 分ブロッキング後、蛍光および化学発光にて α-Tubulin の検出を行った。化学発光検出と同様に蛍光検出においても Bullet Blocking One は使用できた。
| 化学発光 | 蛍光（Alexa647） |
|---|---|
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| サンプル | : | 3T3-L1 細胞 [RIPA Buffer(10x)（#08714-04）を用いて総タンパク質を抽出] |
| ブロッキング | : | Bullet Blocking One for Western Blotting（#13779）室温 5 分反応 |
| 一次抗体 | : | α-Tubulin Antibody（CST #2144）1,000 倍希釈 Can Get Signal® Immunoreaction Enhancer Solution（東洋紡 #NKB-101）を用いて希釈 室温 2 時間反応 |
| 二次抗体 | : | （化学発光）Immun-Star Goat Anti-Rabbit (GAR)-HRP Conjugate（Bio-Rad #1705046）2,000 倍希釈 （蛍光）Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647（サーモフィッシャーサイエンティフィック Invitrogen ブランド #A32733）2,000 倍希釈 Can Get Signal® Immunoreaction Enhancer Solution（東洋紡 #NKB-101）を用いて希釈 室温 1 時間反応 |
| 検出 | : | iBright Imaging System（サーモフィッシャーサイエンティフィック Invitrogen ブランド）で撮影 （化学発光）Clarity Western ECL Substrate（Bio-Rad #1705060) 反応 5 分 露光時間 2.3 秒 （蛍光） 露光時間 1.2 秒 |
Can Get Signal は東洋紡株式会社の登録商標です。
iBright はライフ テクノロジーズ コーポレーションの登録商標です。
ECL は、Cytiva として事業を行う Global Life Sciences Solutions USA LLC およびその関連会社の商標です。
【使用者の評価】
化学発光法による検出、蛍光抗体を用いた検出の両系において、低バックグラウンドで明瞭なバンドが検出された。
Bullet Blocking One を用いた Exportin-1 および GAPDH の検出
Bullet Blocking One を用いて 5 分ブロッキング後、化学発光にて Exportin-1 および GAPDH の検出を行った。
| サンプル | : | 白血病細胞 |
| ブロッキング | : | Bullet Blocking One for Western Blotting（#13779）室温 5 分反応 |
| 一次抗体 | : | 【Exportin-1】Exportin-1/CRM1 (D6V7N) Rabbit mAb（CST ＃46249）1,000 倍希釈 【GAPDH】Anti-GAPDH mAb（MBL ＃M171-3）2,000 倍希釈 Can Get Signal® Immunoreaction Enhancer Solution 1（東洋紡 #NKB-101）を用いて希釈 4℃ 一晩反応 |
| 二次抗体 | : | 【Exportin-1】Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (Jackson #111-035-003) 10,000 倍希釈 【GAPDH】Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) (Jackson #115-035-003) 10,000 倍希釈 Can Get Signal® Immunoreaction Enhancer Solution 2（東洋紡 #NKB-101）を用いて希釈 室温 1 時間反応 |
| 検出 | : | Ez-capture-MG(アトー)で撮影 Chemi-Lumi One Super（#02230）反応 1 分 露光時間 5 秒 |
Can Get Signal は東洋紡株式会社の登録商標です。
FAQ（よくあるご質問/トラブルシュート）
- Bullet Blocking One for Western Blotting は、どのような製品ですか？
- 本製品は、ウェスタンブロッティング専用の高速ブロッキング剤です。 本製品の使用により、5 分でブロッキングが完了します。
- 使用方法を教えてください。
- イムノブロッティング膜のブロッキングの場合、本製品の原液に膜を浸し、5 分間振とうしてください。 使用方法の詳細は、取扱説明書をご参照ください。
- ブロッキング後、洗浄する必要はありますか？
- 本製品を用いてブロッキング後、tTBS でのリンスを推奨しております。
- Bullet Blocking One for Western Blotting に含まれている成分を教えてください。
- 本製品は、BSA、高分子化合物、両親媒性化合物、防腐剤、緩衝液を含みます。 高分子化合物、両親媒性化合物、防腐剤の詳細については非公開です。組成及び成分情報の詳細は、SDS をご参照ください。
- 有効期限を教えてください。
- 本製品の有効期限は、未開封品で製造後 12 ヶ月です。 ラベルに有効期限を記載しておりますので、ご確認ください。
- 凍結保存は可能ですか？
- 保証外です。 凍結融解により、沈殿が生じる可能性があります。本製品は防腐剤が含まれているため、開封後も凍結保存する必要はありません。
- ELISA、免疫組織染色への適応は可能ですか？
- 保証外です。 本製品は、イムノブロッティング専用ブロッキング剤です。
- 蛍光検出ウェスタンブロッティングへの適応は可能ですか？
- 可能です。 本製品を用いて蛍光ウェスタンブロッティングを実施した結果を HP に掲載しておりますので、ご参照ください。
- 抗体希釈液として使用可能ですか？
- 可能です。 使用する抗体の種類や濃度等の条件により、最適な本製品の希釈倍率が異なるため、予備検討を行っていただく必要があります。本製品の抗体希釈液としての使用例は、BULLETIN L-137 または当社 HP をご参照ください。抗体反応時間の短縮を希望される場合、抗体反応が従来の約半分の時間で完了する Bullet ImmunoReaction Buffer（#18439）をご使用ください。
- Bullet Blocking One for Western Blotting で希釈した抗体溶液の保存は可能ですか？
- 当社では、本製品で希釈した抗体溶液を保存したデータを保有しておりません。 したがって、予備検討を行っていただく必要があります。
- Bullet Blocking One for Western Blotting を抗体希釈液として用いる場合、milliQ で希釈することは可能ですか？
- 当社では、本製品を milliQ で希釈し、使用したデータを保有しておりません。 本製品を希釈する際は、tTBS または tPBS の使用を推奨しております。
- Bullet Blocking One for Western Blotting は、リン酸化タンパク質に対して適用可能ですか？
- 使用される抗体によっては、本製品に含まれるウシ由来タンパク質と反応し、バックグラウンドが高くなる可能性があるため、予備検討を行っていただく必要があります。 リン酸化タンパク質を検出する際は、カゼインフリーで内因性ホスファターゼ非含有ブロッキングワン P（#05999）を推奨しております。
- Bullet Blocking One for Western Blotting は、アセチル化タンパク質やメチル化タンパク質といった修飾タンパク質に対して、適用可能ですか
- 当社では、本製品の修飾タンパク質への適用に関するデータを保有しておりません。 したがって、予備検討を行っていただく必要があります。
- ELISA やイムノブロッティングの過程で、ブロッキングワン各種（#03953、#05999、#13779）、シグナル増強剤 HIKARI（#02272、#02297）、Bullet ImmunoReaction Buffer（#18439）を併用することは可能ですか？
- 可能です。 ブロッキングワン各種でブロッキング後、抗体希釈液として、ブロッキングワン各種（希釈したもの）、シグナル増強剤 HIKARI（#02272、#02297）、Bullet ImmunoReaction Buffer（#18439）のいずれかをご使用ください。ただし、併用とは異なる製品同士を混合して使用するという意味ではありませんので、ご注意ください。
- Bullet Blocking One for Western Blotting の再利用は可能ですか？
- 保証外です。 本製品を繰り返し使用すると、安定した性能が得られない可能性があるため、再利用は推奨しておりません。
- HP に掲載されている実施例において、5% スキムミルクの代わりに 20 倍希釈の Bullet Blocking One for Western Blotting を抗体希釈液として使用すると強いシグナルを得たとありますが、本製品はシグナル増強剤 HIKARI（#02272、#02297）と比較してどの程度シグナル増強効果がありますか？
- 本製品はブロッキング剤であり、シグナル増強効果は副次的なもので、抗体の種類や分析条件によって異なります。 シグナル増強を目的とする場合、シグナル増強剤 HIKARI（#02272、#02297）をご使用ください。
- ブロッキングワン（#03953）、ブロッキングワン P（#05999）、Bullet Blocking One（#13779）において、ブロッキング時間が異なる理由を教えてください。
- ブロッキングワン各種製品のブロッキング時間の違いは、組成及び成分の違いによるものです。 ブロッキングワン P は、ブロッキングワンと基本構成成分となる高分子化合物は同じですが、りん酸化タンパク質の検出に適した組成及び成分となっております。また、Bullet Blocking One は、両親媒性化合物の効果により、短時間でブロッキングワンと同等の効果が得られます。
- 取扱説明書に記載されている時間より長くブロッキングした場合、ブロッキング効果は強まりますか？
- 長時間のブロッキングはシグナルの低下につながる恐れがあるため、取扱説明書に記載されている時間以上の処理は推奨しておりません。 本製品のブロッキング処置時間とブロッキング効果に関しては、BULLETIN L-137、または当社 HP をご参照ください。
- ブロッキング処理を長時間行い、シグナル強度が下がった場合、tPBS 等で洗浄することでシグナルの減弱を抑えることは可能ですか？
- オーバーブロックとなった場合、洗浄を行っても、シグナルの減弱を抑えることはできません。
- Bullet Blocking One for Western Blotting を使用した際に、ムラが発生する場合、改善策はありますか？
- メンブレンが本製品に十分に浸っていないと、ムラが発生する場合があります。 メンブレンに本製品が均一に行き渡るように、使用量と振とう条件の見直しを行ってください。
価格表
| 製品名 | 規格 | 貯法 | 製品番号 | 容量 | オンライン カタログへ |
|---|---|---|---|---|---|
| Bullet Blocking One for Western Blotting | SP | 冷蔵 | 13779-56 | 50 mL |  |
| 13779-14 | 200 mL | ||||
| 13779-01 | 1 L |
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Bullet シリーズは SDS-PAGE から CBB 染色もしくはウェスタンブロッティングを高速化する試薬です。 シリーズすべてを使用していただくことにより、CBB 染色が約 30 分、ウェスタンブロッティングが約 2 時間で完了できます。
| 工程 | 製品名 | 時間 |
|---|---|---|
| SDS-PAGE | Bullet PAGE Plus Precast Gel | 電気泳動 10 分 |
| CBB 染色 | Bullet CBB Stain Lite | CBB 染色 15 分 |
| 転写 | Bullet Semi-dry Transfer One | 転写 10 分 |
| ブロッキング | Bullet Blocking One | ブロッキング 5 分 |
| 抗原抗体反応 | Bullet ImmunoReaction Buffer | 反応時間を半分に短縮 |
※掲載内容は予告なく変更になる場合があります。