Clone	GF090R
Isotype	IgG2a（Rat）
Size	500μg
Antibody Protein	2mg antibody/ml agarose
Product form	1:1 suspension in Dulbecco's PBS(-)

実験概要

1. EGFPまたはEGFP-myosinを発現するHEK-293細胞のライセート1mlに、抗GFP抗体アガロースを20μlそれぞれ添加し、4℃で2時間免疫沈降した。
2. SDSサンプルバッファーを加え、90℃で10分間処理し、SDS-PAGEを行った。
3. 抗GFP抗体を用いてウェスタンブロッティングにより、EGFPとEGFP-myosinを検出した。 

データご提供：

京都大学 生命科学研究科 高次生命科学専攻 高次生体統御学 垣塚研究室
垣塚 彰 教授 / 堀 清次 講師 / 笹岡 紀男 研究員

Kumeta, M et al. Molecular mechanisms underlying nucleocytoplasmic shuttling of actinin-4. J Cell Sci. 123(Pt 7), 1020-30 (2010).

c-Mycタグの付いたプラスミドを細胞にトランスフェクションしました。その後細胞ライセートをc-Myc-Agarose抗体で免疫沈降し、ウェスタンブロッティングでの検出を行いました。

免疫沈降	Anti-c-Myc, Agarose conjugate（1:500）
ウェスタンブロッティング	Anti-c-Myc（#04362）

データご提供：国立大学　研究者

c-Myc tagged Proteinとの反応

実験概要

1. 均一に懸濁させたAnti-c-Myc-Agarose（#04145-55）0.05mlをフタ付きポリプロピレン容器（0.5ml）に分注し、Rinse buffer 0.4ml、およびc-Myc tagged protein（1mg/ml）1μlを添加して静かに転倒攪拌する（室温、2時間）。
2. 遠心分離（10秒間）で樹脂を沈殿させた後、Rinse bufferを分注器で吸引除去する。さらに、新たなRinse buffer 0.4mlを加えて転倒攪拌（10秒間）して遠心分離する。（5回繰り返し）
3. Rinse bufferを濾紙片で十分に吸引除去したAgarose樹脂、未使用の同Agarose樹脂、およびフタ付きポリプロピレン容器（0.5 ml）に分注したc-Myc tagged protein（1mg/ml）1μl、の各々にSDS-PAGE電気泳動緩衝液（+2ME）0.05mlを添加して煮沸水浴で加熱（5分間）する。
4. 水冷後に遠心分離（10秒間）して、各上清1μlをSDS-PAGE（10%）で電気泳動する。

*Rinse buffer:50mM Tris-HCl pH7.5, 150mM NaCl, 1%(v/v)NP-40, 10mM EDTA, 1mM PMSF, 10μM pepstatin, 20μM leupeptin

SDS-PAGE（10%）	30mA constant, 60分
サンプル	①M.W. Marker ②Anti-c-Myc-Agarose + c-Myc tagged protein ③Anti-c-Myc-Agarose ④c-Myc tagged protein

結果

Anti-c-Myc-Agarose（左図③）にc-Myc tagged protein（左図④）を反応させた結果、c-Myc tagged proteinはAgarose樹脂に結合した（左図②）。

非特異吸着の確認

実験概要

使用例2と同様の手順でc-Myc tagged protein（1mg/ml）をbacterial lysate 1μlに変えて操作しました。

SDS-PAGE（10%）	30mA constant, 60分
サンプル	①M.W. Marker ②Anti-bacterial lysate ③Anti-c-Myc-Agarose + bacterial lysate

結果

不特定多数のタンパク質を含有するbacterial lysateをAnti-c-Myc-Agaroseに反応させても、非特異的なタンパク質の樹脂吸着はほとんどおこっていません。