製品情報

ウェスタンブロッティング用高速ブロッキング剤Bullet Blocking One for Western Blotting

本製品はウェスタンブロッティング専用のブロッキング剤です。両親媒性化合物の効果により、わずか 5 分のインキュベート時間で弊社 Blocking One と同等の性能を発揮します。

特長

  • わずか 5 分でブロッキングが完了

実施例 1

Bullet Blocking One と Blocking One およびスキムミルクのブロッキング効果

超高感度検出試薬 Chemi-Lumi One Ultra を使用し、ウェスタンブロッティングを実施した。Bullet Blocking One は、わずか 5 分のブロッキング時間で、他の方法と同等の効果を示した。

ブロッキング剤
ブロッキング時間
Bullet Blocking One
5 分
Blocking One
30 分
5% スキムミルク
60 分
ブロッティング像 BulletBlockingOne.jpg BlockingOne.jpg Skimmilk.jpg

実験条件

サンプル HeLa 細胞タンパク質抽出液 20 µg より 2 倍希釈系列
SDS-PAGE Bullet PAGE One 5-15%(#13080-44) / 泳動用緩衝液(#30329)
400 V、10 分
転写 セミドライ ウェスタンブロッティング用転写緩衝液(#30650-31)
10 V、30分
洗浄 0.1%-tTBS(#12750-81 を 10 倍希釈で使用)
ブロッキング 各ブロッキング剤で各時間ブロッキング
一次抗体 Vimentin (C-20)-R(Santa Cruz #sc-7557-R)
2,000 倍希釈 室温、1 時間
二次抗体 Goat Anti-Rabbit IgG-HRP(Santa Cruz #sc-2004)
100,000 倍希釈 室温、1 時間
検出 Chemi-Lumi One Ultra(#11644)反応 5 分
LAS-3000(High モード)露光時間 15 分

他社比較

Bullet Blocking One と他社品、従来組成ブロッキング剤との比較

Blocking One、他社品、従来組成ブロッキング剤では 5 分のブロッキング処置で十分な効果が得られない一方、Bullet Blocking One ではわずか 5 分で十分なブロッキング効果が得られた。

反応時間 5 分ブロッキング剤各ブロッキング剤
添付文書記載反応時間
hikaku_Dot_BulletBlockingOne.jpg Bullet Blocking One
hikaku_Dot_BlockingOne_5.jpg Blocking One hikaku_Dot_BlockingOne_30_.jpg 30 分
hikaku_Dot_A_5.jpg A 社ブロッキング剤 hikaku_Dot_A_60.jpg 60 分
hikaku_Dot_B_5.jpg B 社ブロッキング剤 hikaku_Dot_B_30.jpg 30 分
hikaku_Dot_C_5.jpg C 社ブロッキング剤
(protein-free)
hikaku_Dot_C_60.jpg 60 分
hikaku_Dot_Skimmilk_5.jpg 5% スキムミルク
in 0.05% Tween 20-TBS
hikaku_Dot_Skimmilk_60.jpg 60 分
hikaku_Dot_BSA_5.jpg 3% BSA
in 0.05% Tween 20-TBS
hikaku_Dot_BSA_60.jpg 60 分

マウス血清をドットブロットした PVDF 膜を TBS で洗浄後、それぞれのブロッキング剤でブロッキングした。Goat Anti-Mouse IgG-HRP(Santa Cruz #sc-2005)(1:5,000 in 0.01%-tTBS)を反応後、0.05%-tTBS で洗浄し、Chemi-Lumi One Super(#02230)を反応させた。検出には LAS-3000(High モード)を用い、90 秒露光した。

Tween は、クローダ インターナショナル ピーエルシーの登録商標です。

性能確認

Bullet Blocking One のブロッキング処置時間とブロッキング効果

Bullet Blocking One はスキムミルクよりも速くブロッキングが終了していることが示された。

seinoukakunin.png

マウス血清をドットブロットした PVDF 膜を TBS で洗浄後、Bullet Blocking One、5% スキムミルク in 0.05%-tTBS でブロッキングした。Goat Anti-Mouse IgG-HRP(Santa Cruz #sc-2005)(1:5,000 in 0.01%-tTBS)を反応後、0.05%-tTBS で洗浄し、Chemi-Lumi One Super(#02230)を反応させた。検出には LAS-3000(High モード)を用い、60 秒露光させて得られたデータを Multi Gauge により解析した。

実施例 2

Bullet Blocking One をブロッキングおよび抗体希釈時に使用した実施例

Bullet Blocking One は 5 分の短時間で十分なブロッキング効果を発揮できることが確認された。また、抗体の種類・品質で抗体希釈液の条件検討は必要であるが、本条件下においては、Bullet Blocking One を抗体の希釈液として用いることで強いシグナルを得ることができた。

条件検討 条件① 条件② 条件③
ブロッティング像 siyourei_Bullet_Bullet.jpg siyourei_Bullet_milk.jpg siyourei_milk_milk_60.jpg
ブロッキング剤
ブロッキング時間
Bullet Blocking One
5 分
Bullet Blocking One
5 分
5% スキムミルク
60 分
抗体希釈液 Bullet Blocking One
20 倍希釈
5% スキムミルク 5% スキムミルク
一次抗体 Anti-UCP1 2,000 倍希釈 室温、 1 時間
二次抗体 Anti-Rabbit IgG 2,000 倍希釈 室温、1 時間

データご提供:京都大学大学院 農学研究科 食品生物科学専攻 食品分子機能学分野 後藤 剛 准教授 / 金 珉智 研究員

実施例 3

蛍光ウェスタンブロッティングにおいて Bullet Blocking One を使用した実施例

Bullet Blocking One を用いて 5 分ブロッキング後、蛍光および化学発光にて α-Tubulin の検出を行った。化学発光検出と同様に蛍光検出においても Bullet Blocking One は使用できた。

化学発光 蛍光(Alexa647)
jissirei3-kagakuhakkou.png jissirei3-keikou.png

実験条件

サンプル

3T3-L1 細胞 [RIPA Buffer(10x)#08714-04を用いて総タンパク質を抽出]

ブロッキング

Bullet Blocking One for Western Blotting#13779)室温 5 分反応

一次抗体

α-Tubulin Antibody(CST #2144)1,000 倍希釈

Can Get Signal® Immunoreaction Enhancer Solution(東洋紡 #NKB-101)を用いて希釈 室温 2 時間反応

二次抗体

(化学発光)Immun-Star Goat Anti-Rabbit (GAR)-HRP Conjugate(Bio-Rad #1705046)2,000 倍希釈

(蛍光)Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647(Thermo Fisher Scientific #A32733)2,000 倍希釈

Can Get Signal® Immunoreaction Enhancer Solution(東洋紡 #NKB-101)を用いて希釈 室温 1 時間反応

検出

iBright Imaging System(Thermo Fisher Scientific)で撮影

(化学発光)Clarity Western ECL Substrate(Bio-Rad #1705060)  反応 5 分 露光時間 2.3 秒

(蛍光) 露光時間 1.2 秒

Can Get Signal® は東洋紡株式会社の登録商標です。

使用者の評価

化学発光法による検出、蛍光抗体を用いた検出の両系において、低バックグラウンドで明瞭なバンドが検出された。

データご提供:神奈川工科大学 応用バイオ科学科 食品機能学研究室 田中 理恵子 助教

実施例 4

Bullet Blocking One を用いた Exportin-1 および GAPDH の検出

Bullet Blocking One を用いて 5 分ブロッキング後、化学発光にて Exportin-1 および GAPDH の検出を行った。

Bullet-jissirei4_1.png

実験条件

サンプル

白血病細胞

ブロッキング

Bullet Blocking One for Western Blotting(#13779)室温 5 分反応

一次抗体

【Exportin-1】Exportin-1/CRM1 (D6V7N) Rabbit mAb(CST #46249)1,000 倍希釈

【GAPDH】Anti-GAPDH mAb(MBL #M171-3)2,000 倍希釈

Can Get Signal® Immunoreaction Enhancer Solution 1(東洋紡 #NKB-101)を用いて希釈 4℃ 一晩反応

二次抗体

【Exportin-1】Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (Jackson #111-035-003) 10,000 倍希釈

【GAPDH】Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) (Jackson #115-035-003) 10,000 倍希釈

Can Get Signal® Immunoreaction Enhancer Solution 2(東洋紡 #NKB-101)を用いて希釈 室温 1 時間反応

検出

Ez-capture-MG(ATTO)で撮影

Chemi-Lumi One Super(#02230)反応 1 分 露光時間 5 秒

Can Get Signal® は東洋紡株式会社の登録商標です。


データご提供:医薬基盤健康栄養研究所 細胞核輸送ダイナミクスプロジェクト 様

使用例

本製品もしくは各ブロッキング剤でブロッキング後、さらに抗体希釈液としても本製品もしくは各ブロッキング剤を使用し、ウェスタンブロッティングを実施した。 

Bullet Blocking One の抗体希釈液としての使用例

非特異バンドが出現しやすい抗体を使用した場合(上段)、本製品の原液を抗体希釈液として使用すると効果的に非特異バンドが抑制された。一方、非特異バンドが出にくい抗体を使用した場合(下段)、抗体希釈液に含有させた本製品によりオーバーブロッキングされ、感度が低下した。

ブロッティング像
抗体:COX4(Goat Polyclonal Antibody)
siyourei_1.png siyourei_2.png siyourei_3.png siyourei_4.png
ブロッティング像
抗体:β-Actin(Mouse Monoclonal Antibody)
siyourei_5.png siyourei_6.png siyourei_7.png siyourei_8.png
ブロッキング剤
ブロッキング時間
Bullet Blocking One
5 分
抗体希釈液 Bullet Blocking One
20 倍希釈
Bullet Blocking One
5 倍希釈
Bullet Blocking One
原液
0.1%-tTBS

各ブロッキング剤の使用条件から Bullet Blocking One への移行例

5% スキムミルクの使用条件の場合では、本製品でブロッキング後、本製品の原液を抗体希釈液として使用すると同等の効果が得られた。一方で、Blocking One の使用条件の場合では、 本製品でブロッキング後、 本製品(20 倍希釈)を抗体希釈液として使用すると同等の効果が得られた。

使用条件 5% スキムミルクからの移行例 Blocking One からの移行例
ブロッティング像
抗体:COX4(Goat Polyclonal Antibody)
siyourei_9.png yajirusi_3.png siyourei_10.png siyourei_11.png yajirusi_3.png siyourei_12.png
ブロッティング像
抗体:β-Actin(Mouse Monoclonal Antibody)
siyourei_13.png yajirusi_3.png siyourei_14.png siyourei_15.png yajirusi_3.png siyourei_16.png
ブロッキング剤
ブロッキング時間
5% スキムミルク
60 分
yajirusi_3.png Bullet Blocking One
5 分
Blocking One
30 分
yajirusi_3.png Bullet Blocking One
5 分
抗体希釈液 5% スキムミルク yajirusi_3.png Bullet Blocking One
原液
Blocking One
20 倍希釈
yajirusi_3.png Bullet Blocking One
20 倍希釈

実験条件

サンプル HeLa 細胞タンパク質抽出液 10 µg より 2 倍希釈系列
ブロッキング 各ブロッキング剤で各時間反応
一次抗体 上段)COX4(D-20)(Santa Cruz #sc-69359)500 倍希釈 室温、1 時間
下段)β-Actin(C4)(Santa Cruz #sc-47778)1,000 倍希釈 室温、1 時間
二次抗体 上段)Bovine Anti-Goat IgG-HRP(Santa Cruz #sc-2350)5,000 倍希釈 室温、1 時間
下段)Goat Anti-Mouse IgG-HRP(Santa Cruz #sc-2005)20,000倍希釈 室温、1 時間
検出 Chemi-Lumi One Super(#02230)反応 1 分、LAS-3000(High モード)露光時間 (上段)10 分 (下段)5 分

本製品は他のブロッキング剤と同様に、ブロッキングおよび抗体希釈液の両方でご使用いただけます。ただし、本製品の抗体希釈液としての使用の適否および至適使用濃度は、使用する抗体の種類などの条件により異なります。

使用方法

膜を十分量の本製品に浸して 5 分振とうしてください(目安として 10 cm × 10 cm 程度の膜では本製品 50 mL を使用してください)。

Bullet Blocking One を用いた長時間のブロッキングでは、オーバーブロッキングによりシグナルが減弱する場合があります。

価格表

製品名規格貯法製品番号容量オンライン
カタログへ
Bullet Blocking One for Western Blotting SP 冷蔵 13779-56 50 mL e-Nacalai.jpg
13779-14 200 mL
13779-01 1 L

※データをご提供いただきました研究者の皆さまのご所属  などの情報は、データご提供時の情報に基づいています。
※記載の内容は、'19 年 8 月現在の情報に基づいております。