超高感度検出試薬 Chemi-Lumi One Ultra を使用し、ウェスタンブロッティングを実施した。Bullet Blocking One は、わずか 5 分のブロッキング時間で、ほかの方法と同等の効果を示した。

ブロッキング剤 ブロッキング時間	Bullet Blocking One 5 分	Blocking One 30 分	5% スキムミルク 60 分
ブロッティング像

実験条件

サンプル	HeLa 細胞タンパク質抽出液 20 µg より 2 倍希釈系列
SDS-PAGE	Bullet PAGE One 5-15%（#13080-44） / 泳動用緩衝液（#30329） 400 V、10 分
転写	セミドライ ウェスタンブロッティング用転写緩衝液（#30650-31） 10 V、30分
洗浄	0.1%-tTBS（#12750-81 を 10 倍希釈で使用）
ブロッキング	各ブロッキング剤で各時間ブロッキング
一次抗体	Vimentin (C-20)-R（Santa Cruz #sc-7557-R） 2,000 倍希釈　室温、1 時間
二次抗体	Goat Anti-Rabbit IgG-HRP（Santa Cruz #sc-2004） 100,000 倍希釈　室温、1 時間
検出	Chemi-Lumi One Ultra（#11644）反応 5 分 LAS-3000（High モード）露光時間 15 分

Blocking One、他社品、従来組成ブロッキング剤では 5 分のブロッキング処置で十分な効果が得られない一方、Bullet Blocking One ではわずか 5 分で十分なブロッキング効果が得られた。

反応時間 5 分	ブロッキング剤	各ブロッキング剤 添付文書記載反応時間
	Bullet Blocking One
	Blocking One		30 分
	A 社ブロッキング剤		60 分
	B 社ブロッキング剤		30 分
	C 社ブロッキング剤 （protein-free）		60 分
	5% スキムミルク in 0.05％ Tween 20-TBS		60 分
	3% BSA in 0.05% Tween 20-TBS		60 分

マウス血清をドットブロットした PVDF 膜を TBS で洗浄後、それぞれのブロッキング剤でブロッキングした。Goat Anti-Mouse IgG-HRP（Santa Cruz #sc-2005）（1:5,000 in 0.01%-tTBS）を反応後、0.05%-tTBS で洗浄し、Chemi-Lumi One Super（#02230）を反応させた。検出には LAS-3000（High モード）を用い、90 秒露光した。

Tween は、クローダ インターナショナル ピーエルシーの登録商標です。

Bullet Blocking One はスキムミルクよりも速くブロッキングが終了していることが示された。

マウス血清をドットブロットした PVDF 膜を TBS で洗浄後、Bullet Blocking One、5% スキムミルク in 0.05%-tTBS でブロッキングした。Goat Anti-Mouse IgG-HRP（Santa Cruz #sc-2005）（1:5,000 in 0.01%-tTBS）を反応後、0.05%-tTBS で洗浄し、Chemi-Lumi One Super（#02230）を反応させた。検出には LAS-3000（High モード）を用い、60 秒露光させて得られたデータを Multi Gauge により解析した。

Bullet Blocking One は 5 分の短時間で十分なブロッキング効果を発揮できることが確認された。また、抗体の種類・品質で抗体希釈液の条件検討は必要であるが、本条件下においては、Bullet Blocking One を抗体の希釈液として用いることで強いシグナルを得ることができた。

条件検討	条件①	条件②	条件③
ブロッティング像
ブロッキング剤 ブロッキング時間	Bullet Blocking One 5 分	Bullet Blocking One 5 分	5% スキムミルク 60 分
抗体希釈液	Bullet Blocking One 20 倍希釈	5% スキムミルク	5% スキムミルク
一次抗体	Anti-UCP1　2,000 倍希釈　室温、 1 時間
二次抗体	Anti-Rabbit IgG　2,000 倍希釈　室温、1 時間

データご提供：京都大学大学院 農学研究科 食品生物科学専攻 食品分子機能学分野　後藤 剛 准教授 / 金 珉智 研究員

Bullet Blocking One を用いて 5 分ブロッキング後、蛍光および化学発光にて α-Tubulin の検出を行った。化学発光検出と同様に蛍光検出においても Bullet Blocking One は使用できた。

化学発光	蛍光（Alexa647）

実験条件

サンプル	3T3-L1 細胞 [RIPA Buffer(10x)（#08714-04）を用いて総タンパク質を抽出]
ブロッキング	Bullet Blocking One for Western Blotting（#13779）室温　5 分反応
一次抗体	α-Tubulin Antibody（CST #2144）1,000 倍希釈 Can Get Signal® Immunoreaction Enhancer Solution（東洋紡 #NKB-101）を用いて希釈　室温　2 時間反応
二次抗体	（化学発光）Immun-Star Goat Anti-Rabbit (GAR)-HRP Conjugate（Bio-Rad #1705046）2,000 倍希釈 （蛍光）Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647（サーモフィッシャーサイエンティフィック Invitrogen ブランド #A32733）2,000 倍希釈 Can Get Signal® Immunoreaction Enhancer Solution（東洋紡 #NKB-101）を用いて希釈　室温　1 時間反応
検出	iBright Imaging System（サーモフィッシャーサイエンティフィック Invitrogen ブランド）で撮影 （化学発光）Clarity Western ECL Substrate（Bio-Rad #1705060)  反応 5 分　露光時間 2.3 秒 （蛍光） 露光時間 1.2 秒

Can Get Signal^® は東洋紡株式会社の登録商標です。

iBright はライフ　テクノロジーズ　コーポレーションの登録商標です。

ECL は、Cytiva として事業を行う Global Life Sciences Solutions USA LLC およびその関連会社の商標です。

使用者の評価

化学発光法による検出、蛍光抗体を用いた検出の両系において、低バックグラウンドで明瞭なバンドが検出された。

データご提供：神奈川工科大学 応用バイオ科学科 食品機能学研究室　田中 理恵子 助教

Bullet Blocking One を用いて 5 分ブロッキング後、化学発光にて Exportin-1 および GAPDH の検出を行った。

実験条件

サンプル	白血病細胞
ブロッキング	Bullet Blocking One for Western Blotting（#13779）室温　5 分反応
一次抗体	【Exportin-1】Exportin-1/CRM1 (D6V7N) Rabbit mAb（CST ＃46249）1,000 倍希釈 【GAPDH】Anti-GAPDH mAb（MBL ＃M171-3）2,000 倍希釈 Can Get Signal® Immunoreaction Enhancer Solution 1（東洋紡 #NKB-101）を用いて希釈　4℃　一晩反応
二次抗体	【Exportin-1】Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)　(Jackson #111-035-003) 10,000 倍希釈 【GAPDH】Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)　(Jackson #115-035-003) 10,000 倍希釈 Can Get Signal® Immunoreaction Enhancer Solution 2（東洋紡 #NKB-101）を用いて希釈　室温　1 時間反応
検出	Ez-capture-MG(アトー)で撮影 Chemi-Lumi One Super（#02230）反応 1 分　露光時間 5 秒

Can Get Signal^® は東洋紡株式会社の登録商標です。

データご提供：医薬基盤健康栄養研究所　細胞核輸送ダイナミクスプロジェクト 様

本製品もしくは各ブロッキング剤でブロッキング後、さらに抗体希釈液としても本製品もしくは各ブロッキング剤を使用し、ウェスタンブロッティングを実施した。　

Bullet Blocking One の抗体希釈液としての使用例

非特異バンドが出現しやすい抗体を使用した場合（上段）、本製品の原液を抗体希釈液として使用すると効果的に非特異バンドが抑制された。一方、非特異バンドが出にくい抗体を使用した場合（下段）、抗体希釈液に含有させた本製品によりオーバーブロッキングされ、感度が低下した。

ブロッティング像 抗体：COX4（Goat Polyclonal Antibody）
ブロッティング像 抗体：β-Actin（Mouse Monoclonal Antibody）
ブロッキング剤 ブロッキング時間	Bullet Blocking One 5 分
抗体希釈液	Bullet Blocking One 20 倍希釈	Bullet Blocking One 5 倍希釈	Bullet Blocking One 原液	0.1%-tTBS

各ブロッキング剤の使用条件から Bullet Blocking One への移行例

5％ スキムミルクの使用条件の場合では、本製品でブロッキング後、本製品の原液を抗体希釈液として使用すると同等の効果が得られた。一方で、Blocking One の使用条件の場合では、 本製品でブロッキング後、 本製品（20 倍希釈）を抗体希釈液として使用すると同等の効果が得られた。

使用条件	5% スキムミルクからの移行例			Blocking One からの移行例
ブロッティング像 抗体：COX4（Goat Polyclonal Antibody）
ブロッティング像 抗体：β-Actin（Mouse Monoclonal Antibody）
ブロッキング剤 ブロッキング時間	5% スキムミルク 60 分		Bullet Blocking One 5 分	Blocking One 30 分		Bullet Blocking One 5 分
抗体希釈液	5% スキムミルク		Bullet Blocking One 原液	Blocking One 20 倍希釈		Bullet Blocking One 20 倍希釈

実験条件

サンプル	HeLa 細胞タンパク質抽出液 10 µg より 2 倍希釈系列
ブロッキング	各ブロッキング剤で各時間反応
一次抗体	上段）COX4(D-20)（Santa Cruz #sc-69359）500 倍希釈　室温、1 時間 下段）β-Actin(C4)（Santa Cruz #sc-47778）1,000 倍希釈　室温、1 時間
二次抗体	上段）Bovine Anti-Goat IgG-HRP（Santa Cruz #sc-2350）5,000 倍希釈　室温、1 時間 下段）Goat Anti-Mouse IgG-HRP（Santa Cruz #sc-2005）20,000倍希釈　室温、1 時間
検出	Chemi-Lumi One Super（#02230）反応 1 分、LAS-3000（High モード）露光時間 （上段）10 分 （下段）5 分

本製品はほかのブロッキング剤と同様に、ブロッキングおよび抗体希釈液の双方でご使用いただけます。ただし、本製品の抗体希釈液としての使用の適否および至適使用濃度は、使用する抗体の種類などの条件により異なります。

膜を十分量の本製品に浸して 5 分振とうしてください（目安として 10 cm × 10 cm 程度の膜では本製品 50 mL を使用してください）。

Bullet Blocking One を用いた長時間のブロッキングでは、オーバーブロッキングによりシグナルが減弱する場合があります。

Bullet シリーズは SDS-PAGE から CBB 染色もしくはウェスタンブロッティングを高速化する試薬です。 シリーズすべてを使用していただくことにより、CBB 染色が約 30 分、ウェスタンブロッティングが約 2 時間で完了できます。

工程	製品名	時間
SDS-PAGE	Bullet PAGE Plus Precast Gel	電気泳動 10 分
CBB 染色	Bullet CBB Stain Lite	CBB 染色 15 分
転写	Bullet Semi-dry Transfer One	転写 10 分
ブロッキング	Bullet Blocking One	ブロッキング  5 分
抗原抗体反応	Bullet ImmunoReaction Buffer	反応時間を半分に短縮